赖芷迎，何文美，陈伟萍，姚婉清

（嘉应学院化学与环境学院，广东 梅州 514015）

我国拥有丰富的山苍子（Litsea cubeba）资源，山苍子又名山鸡椒、山胡椒、木姜子，属于樟科木姜子属[1]，常用于提取山苍子油。山苍子油的主要成分是柠檬醛，其具有抗真菌的效果，广泛应用于香料合成、医疗保健、食品保鲜等领域，有抑菌、灭菌、驱虫等作用[2]。林岗[3]等采用扫描电镜和透射电镜观察到山苍子精油可以破环同丝水霉卵孢子的细胞壁、水霉卵孢子内脂质体外膜结构，对同丝水霉的菌丝生长具有抑制作用。因此，山苍子也常被应用于水产养殖业[4-6]，对患有水霉病的病鱼具有良好的疗效。水霉菌还会影响其他水生生物的生态健康，浮游动物作为水生生态系统的重要组成部分，其生存和健康状态对生态系统的稳定和可持续发展至关重要。

大型蚤处于水生生态系统中物质循环和能量流动的关键环节，在水生态食物链起承上启下的作用[7]。蚤类主要摄食水中的藻类，可以控制藻类爆发，而且其本身含有大量的蛋白质、钙等营养物质，是鱼类重要的食物来源之一。大型蚤也常被作为水体健康的重要指标，它对水生态环境的变化非常敏感，易受到水中污染物、致病微生物如水霉菌、真菌等影响。

本文以大型蚤为试验生物，研究山苍子投放对蚤的生长繁殖的影响，探究山苍子作为水生态健康调节剂的应用前景。

1 实验材料和方法

1.1 材料

山苍子由嘉应学院彭梦侠老师课题组提供[8]，产地为广西桂林；柠檬醛（C10H16O）含量为4.66%；大型蚤和蛋白核小球藻由暨南大学水生生物研究所赠与。大型蚤的培养和试验温度为23℃± 2℃，光暗比为16 h∶8 h，每只大型蚤有10～15 mL 水的生存空间，以保证大型蚤在孤雌生殖的状态下。选用实验室条件下孤雌生殖3代以上的同一批母体产出的24～48 h 内的幼蚤为实验蚤。挑选健康幼蚤进行重铬酸钾敏感性测定，符合测定标准重铬酸钾的24 h-LC50为0.5～1.2 mg/L 后进行试验。小球藻采用BG11 培养液培扩增培养，喂蚤的藻液浓度为10.6×106cell/mL。

1.2 实验药剂

山苍子储备液：称取4 g 过35 目筛的山苍子粉末于500 mL 的细口瓶中，分3次加入400 mL 纯水，每次加入100～150 mL，振荡15 min，静置3 h 后取出上清液。三次浸出完成后得到10 mg/mL 的山苍子储备液。其余药品皆为分析纯，玻璃器皿都经过无菌处理。

1.3 山苍子毒性预实验

按照《水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法》（GB/T 13266—91）[9]设置预实验，选用1 mg/mL 和3 mg/mL 为预实验浓度，每杯10 只大型蚤，并设置空白对照组，每组3个平行，24 h后记录其蚤死亡数和蜕壳数。

1.4 大型蚤慢性毒理实验

根据预实验结果确定低、中、高浓度分别为0.02 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL 的慢性毒理实验组，每杯加入10 只大型蚤，并设置空白对照组，每组3 个平行样品。所有实验组放入光照培养箱培养，每24 h 更换一次培养液。每日记录大型蚤的存活数、蜕壳数、死亡数、初次产蚤时间、新生小蚤数。第1 天和第2 天置于显微镜下测量体长，从第3天开始每间隔48 h量一次体长。

1.5 数据统计与处理

利用excel 和origin 统计数据、分析和作图，显著性分析选用bonferroni检验进行两两比对。

2 结果与讨论

2.1 山苍子对大型蚤体长的影响

经过14 天的培养，统计分析结果显示，空白组、0.02 mg/mL 组、0.1 mg/mL 组的蚤的最终体长无显著性差异（p>0.05），但0.02 mg/mL 和0.1 mg/mL 组的大型蚤表现出更快的进食速度和活力，头上的枝角明显粗壮，说明山苍子浓度≤0.1 mg/mL 时，山苍子对蚤的生长有一定的积极作用；0.5 mg/mL 组与其他组的蚤体长有显著性差异（p<0.05），且大型蚤的体宽偏小，活力差，摄食速度缓慢，同时蚤的枝角与身体上被絮状物缠绕，使其运动受到影响。14 天后，山苍子浓度为0.02 mg/mL实验组的大型蚤的体长最长，平均为1.052 mm，浓度为0.5 mg/mL 的蚤体长最短，平均为0.736 mm（图1），说明山苍子投放浓度高于0.5 mg/mL 时，不利于大型蚤的生长。

图1 大型蚤的平均体长变化（n=3）

由大型蚤平均体长（图1）与增长率（图2）可知，山苍子浓度为0.1 mg/mL 组和0.5 mg/mL 组对幼蚤的生长有抑制作用。在第2 天和第4 天，0.1 mg/mL 和0.5 mg/mL 组的幼蚤体长增长率明显低于空白组和0.02 mg/mL实验组（p<0.05），说明山苍子浓度高于0.1 mg/mL 时会抑制幼蚤的生长（图2）。在第6 天，0.1 mg/mL 组的幼蚤的体长增长率显著增加，与空白组、0.02 mg/mL 组和0.5 mg/mL 组的增长率有显著性差异（p<0.05），说明随蚤龄增长，大型蚤体质增强，能够抵抗低浓度山苍子带来的负面影响，恢复正常的生长速率。同时，0.5 mg/mL组的幼蚤的体长增长率无明显增加，说明高浓度的山苍子对幼蚤的生长有抑制作用。从第8 天开始，各个实验组的蚤体长增长速率无显著差异。

图2 大型蚤的每日体长增长率的变化

综上所述，山苍子浓度低于0.1 mg/mL 时可能更有利于成年蚤的生长，鱼类研究学者也报道在山苍子治疗后的水霉病病鱼恢复健康后表现出更好的食欲和活力，推测山苍子抑制了大型蚤培养液中的水霉菌[10-11]或其他致病菌的繁殖，使得大型蚤能够更健康生长。但是，山苍子浓度高于0.5 mg/mL 时，大型蚤的生长明显受到抑制，说明山苍子的投放量应受到严格控制。

2.2 对大型蚤蜕壳数的影响

大型蚤的体长增长是间歇性的，其生长与蜕壳交替进行。山苍子对大型蚤蜕壳数的影响如图3 所示。在14 天培养实验期间，各组的大型蚤的日蜕壳数总体呈下降趋势，山苍子浓度为0.02 mg/mL组的大型蚤的日蜕壳数始终处于高位，空白组和0.1 mg/mL 数量次之，而0.5 mg/mL 组的蜕壳数始终处于最低（p<0.05）（图4）。烧杯中大型蚤在实验第2 天初次蜕壳，0.02 mg/mL 组的蜕壳数量最多，是0.5 mg/mL 组的两倍多（图3），远大于其他两组，而0.5 mg/mL 组的蜕壳数量远小于空白组和0.1 mg/mL 组，说明山苍子的浓度大于0.1 mg/mL 时，幼蚤的蜕壳数明显受到影响。第8 天0.1 mg/mL 组的蜕壳数趋同于空白组，而后超过空白组，说明此时山苍子对幼蚤的退壳影响逐渐变小，最后各组的日蜕壳数趋于相同。

图3 大型蚤的日蜕壳数

图4 大型蚤的累计蜕壳数

从各组的总蜕壳数来看，也是0.02 mg/mL组的数量始终处于最高位，空白组和0.1 mg/mL 数量次之，而0.5 mg/mL 组的蜕壳数始终处于最低（p<0.05）（图4）。尽管在第5 和第6 天，空白组和0.1 mg/mL 数量相同，但是之后空白组的总蜕壳数高于0.1 mg/mL 组，说明山苍子对蚤的体长影响可以通过抑制蜕壳来体现，尤其是当山苍子浓度超过0.5 mg/mL时，退壳数量明显减少，无法顺利退壳，导致大型蚤的生长和发育滞后。

2.3 对大型蚤产蚤数量的影响

山苍子对大型蚤产蚤数量的影响如图5 所示。空白组和0.02 mg/mL 实验组的大型蚤在第6 天开始背卵，0.1 mg/mL在第7天开始背卵，而0.5 mg/mL组在14天的培养过程中始终没有出现背卵现象。在4 个培养组中，0.02 mg/mL 组最早产蚤10 只，比空白组还要多8 只，说明0.02 mg/mL 浓度的山苍子会促使大型蚤提前背卵繁殖。这可能是由于山苍子的抑菌效果和其中含有的内含物为蚤提供了营养物质，但该促进作用并未持续至整个实验周期。在第11 天，空白组、0.02 mg/mL 和0.1 mg/mL 组出现产蚤高峰，其中产蚤数最多的为0.1 mg/mL组，可见该浓度的山苍子使得蚤的繁殖滞后。0.5 mg/mL的产蚤数为0，可见高浓度的山苍子对蚤有一定的生殖毒害作用。

图5 大型蚤每日产蚤数

从大型蚤的产蚤总数来看（图6），空白组的总产蚤数最多，但空白组与0.02 mg/mL 组没有显著性差异（p>0.05），而0.1 mg/mL 组的总产蚤数略低于前两组。0.5 mg/mL 的山苍子生殖毒性显著。此外在培养过程中，除空白组外，其余实验组的新生小蚤在出生24～48 h 后出现少量的死亡，且0.1 mg/mL 组的新生小蚤死亡数比0.02 mg/mL组多，说明虽然0.02 mg/mL对初代蚤的生长和蜕壳无明显影响，但可能会影响到二代蚤的生长。

图6 大型蚤总产蚤数（n=3）

2.4 对大型蚤存活率的影响

从大型蚤存活数量（图7）可知，0.02 mg/mL 组的存活数量最高（90%左右），而0.05 mg/mL 组的最低。山苍子浓度为0.05 mg/mL 的组在第2 天即出现了大型蚤死亡，在第3～5天中死亡率持续增加至30%，并在第10天后继续降低，可见高浓度的山苍子会导致幼蚤迅速死亡，并在蚤成年后还有毒害作用。中浓度0.1 mg/mL 组也从第5 天开始出现了较大量的死亡，直至第7 天存活的蚤数保持在较稳定的水平，可见中浓度的山苍子对幼蚤的毒性明显，但是对成年蚤的毒性较小。值得注意的是，0.02 mg/mL 组的存活数量始终保持在最高水平，而空白组的死亡数在第7天开始逐日增加，甚至在第10天以后，空白组低于0.01 mg/mL组。出现这种情况可能是由于在南方湿热多菌的周边环境中，无抑菌物质的空白组溶液更容易产生致病菌，使幼蚤染病导致死亡，而少量添加山苍子可以抑菌，保持较高的蚤的存活率。第14 天，山苍子浓度为0.02 mg/mL 组的大型蚤存活率最高，为86.7%，且存活数量与其他组呈显著性差异（p<0.05），0.1 mg/mL 组与空白组的存活率分别是73.3%和66.7%，这两组没有呈现显著性差异（p>0.05），存活率最低的0.5 mg/mL组只有56.7%。

图7 大型蚤的存活数

由此可见，中等山苍子浓度时，幼年的大型蚤生长受到山苍子抑制，甚至导致其死亡；随着年龄的增大，蚤体的抵抗力增加，山苍子对其生长的负面作用也慢慢消失，山苍子抑制水中致病菌繁殖，能降低成年蚤的病死率。其次，山苍子具有丰富的蛋白质和可能含有有利于成年蚤生长的营养元素。低浓度的山苍子具有抑制杀灭水中致病菌、真菌的作用，改善水生态环境，有利于浮游生物的健康。

3 结论与展望

山苍子浓度对浮游动物生长繁殖的影响并不是简单的线性关系。山苍子虽然具有抑制水中致病微生物的作用，但是大量使用山苍子（浓度>0.5 mg/mL）能导致水生浮游动物的死亡，且山苍子浓度和浮游动物的死亡率成正相关，不利于水生态系统的良性发展。因此在水产养殖中控制山苍子的使用量非常必要，否则会导致水生蚤类大量死亡，破坏生态平衡，降低经济收益。山苍子的使用浓度低于0.02 mg/mL较为安全，抑制致病菌的同时对浮游动物的繁殖影响较小，而且对其生长有促进作用，对水生态环境的物质循环与能量流动具有积极的作用，可应用于水生生物生长促进剂。山苍子浓度在0.02～0.1 mg/mL 区间内，对幼年浮游动物的生长具有抑制作用，但有利于成年个体的生长，并可能影响下一代幼蚤的存活。山苍子的抑菌作用可调节水生浮游动物的生长环境，淘汰健康状况不佳的个体，得到更为身强体壮的个体。

本研究仅分析山苍子浓度对大型蚤生长繁殖的影响，未测定实验前后水样山苍子主要抑菌成分如柠檬醛的浓度变化。14 天的实验时间对于蚤的生长周期相对较短，未来的实验可以增加实验时长，观察第二代或者第三代的生长状况，探讨长期的影响。将来的研究可以针对山苍子对大型蚤的影响，检测相关酶活性和蛋白质变化，了解山苍子的作用机理。