郭冰雪,林鹏程,吴 疆,周党卫

1.青海民族大学药学院,西宁 810007;2.青海省青藏高原植物化学重点实验室,西宁 810007;3.青海省药物分析重点实验室,西宁 810007

川贝母入药部位为百合科植物卷叶贝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肃贝母(FritillariaprzewalskiiMaxim)、梭砂贝母(FritillariadelavayiFranch)、太白贝母(FritillariataipaiensisP.Y.Li)或瓦布贝母[FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis (S.Y.Tang et S.C.Yue).Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen]的干燥鳞茎[1-3]。2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)一部中对川贝母记载:川贝母味苦、甘,性微寒;归肺、心经,可清热润肺、化痰止咳,浙贝母可清热化痰、解毒散结。《本草纲目拾遗》将川贝与浙贝分开,谓川贝味甘而补肺,不若用象贝治风火痰嗽为佳。若虚寒咳嗽以川贝为宜[4]。中医学认为川贝母有清热润肺、化痰止咳、散结消痈等功效。川贝母临床用量大多数为3～30 g,医治不同疾病时的用量范围也存在差异[5]。川贝母是国家三级保护植物,且价格高昂,因此市场上出现了大批伪品,这些伪品有光慈菇、草贝母、东贝母、浙贝母等,这些伪品与川贝母形态相似,单从形态学难以区分,而且药效与川贝母不同,滥用不仅不能治病,还会延误病情[6-8]。目前2020年版《中国药典》一部中收录的对川贝母的鉴别方法有微观粉末特征鉴别、薄层色谱法鉴别、聚合酶链式反应——限制性内切酶长度多态性方法,为进一步规范川贝母的市场,保障用药安全,近年来对川贝母真伪的研究越来越多,本文对近10年川贝母的真伪鉴别方法进行了总结并分析了各种方法的特点,为以后川贝母的真伪鉴别提供参考[1]。

1 性状鉴定

利用人的感官从药材的质地、色泽、外观形态等辨别川贝母真伪,其结果是否正确主要取决于鉴定者的经验,有一定的主观性。对于川贝母这种近缘物种较多的药材,用此种鉴别方法有一定的难度。根据性状不同,川贝母可分为松贝母、青贝母和炉贝母。炉贝母一般比松贝母和青贝母大。李娜[9]研究发现,川贝母和平贝母的两鳞片存在区别,川贝母的两鳞片抱合较平贝母紧密;川贝母底部较平,平贝母底部较凸。湖北贝母呈扁圆球形,外层鳞叶略呈肾形, 大瓣紧抱小瓣,内有鳞叶几片和干缩的残茎,基部内凹;伊贝母外层鳞叶呈月牙形,基部圆钝, 内有较大的鳞片和残茎、心芽;伊犁贝母较大, 表面稍粗糙,外层鳞叶呈心脏形,基部稍微凹陷;浙贝母质硬而脆[10];东贝母呈卵圆形或长圆形,基部较尖,味极苦[11]。

2 显微鉴别

利用显微镜观察川贝母内部组织结构(例如淀粉粒、表皮细胞、气孔、导管等)的特征辨别真伪,但该方法的缺陷是一般需要破坏川贝母,而且难以显示近源物种之间的关系[12]。松贝、青贝粉末呈白色,淀粉粒多, 有的边缘呈分枝状,脐点呈点状、短缝状, 少数呈人字状或马蹄形;表皮细胞呈类长方形,偶见不定式气孔, 类圆形, 副卫细胞,螺纹导管。炉贝粉末呈白色,脐点呈人字状、星状或点状, 层纹明显, 气孔呈长圆形;螺纹及网纹导管较松贝、青贝长。平贝粉末呈类白色,淀粉粒单粒,脐点呈裂缝状、点状或人字状,气孔呈类圆形,副卫细胞4～6个,螺纹导管直径40～48 mm。伊贝母粉末呈类白色或淡黄白色,淀粉粒单粒,呈广卵形、卵形或贝壳形,直径5～60 mm;脐点点状、人字状,气孔呈不定式。湖北贝母粉末呈淡棕黄色,淀粉粒特别多,呈广卵形或长椭圆形,直径7～54 mm,偶见复粒;脐点明显,呈点状、人字形或裂缝状;层纹明显而细密;气孔呈扁圆形,副卫细胞4～5个;表皮细胞垂周壁呈连珠状增厚,草酸钙结晶棱方形、颗粒状或簇状,直径达50 mm。浙贝母粉末呈类白色至淡黄白色,淀粉粒多为单粒,多呈广卵圆形或椭圆形,直径6～56 mm,脐点多数呈点状或裂缝状,有较大的淀粉粒;层纹明显,呈偏心形,导管多为螺纹状细小导管[13]。

3 理化鉴别

除《中国药典》(2020年版)规定的鉴别方法外,对川贝母的理化鉴别方法有以下几种。

3.1 木尖电喷雾电离质谱分析和多元统计分析结合

木尖电喷雾电离质谱分析法无需复杂样品预处理步骤,可直接分析样品中的生物碱成分[14-15]。XIN G Z等[16]采用木尖电喷雾电离质谱分析和多元统计分析相结合的方法鉴定出贝母的初级代谢物(氨基酸、柠檬酸、糖类等)和次生代谢物(生物碱、黄酮、皂苷等),实现了对川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母的快速鉴别。

3.2 色谱鉴别

薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)是评价川贝母真伪的简便有效方法之一。在2020年版《中国药典》中川贝母的薄层鉴别法中用贝母素乙作为对照品。于国强等[17]采用TLC鉴别法,以西贝母碱斑点作为鉴别依据,在浙贝母、湖北贝母及平贝母薄层色谱图中未见西贝母碱斑点,而川贝母TLC图中可见西贝母碱斑点,此法可用来区分出川贝母与浙贝母、湖北贝母及平贝母。翟映红等[18]优化了药典上的TLC法,按照优化后的TLC实验发现,平贝母比川贝母薄层色谱图多2个斑点,这个特点可用来判断川贝母中是否掺杂平贝母。

生物碱是川贝母的特征性成分,甾体生物碱是川贝母的主要活性成分,通过含量测定方法也可实现对川贝母真伪品的鉴别[19]。周琪等[20]按照2015年版《中国药典》方法对川贝母基源药材进行了含量测定,结果表明,松贝的总生物碱含量平均值为0.046%,青贝的总生物碱含量平均值为0.072%,所以松贝和青贝不仅存在性状上的区别,总生物碱含量也存在差异。LUO D等[21]将超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法结合化学计量学方法包括相似度分析(similarity analysis,SA)、系统聚类分析(hierarchical clustering analysis,HCA)和主成分分析(principal component analysis,PCA)建立了一种特异、实用、有效的指纹图谱分析方法,用于川贝母药材及其混伪品的品种鉴别和质量评价。闵会等[22]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器建立了指纹图谱,此法可用于鉴别并区分浙贝母、平贝母、川贝母药材。

3.3 光谱鉴别

红外光谱是对复杂基质进行定性和定量分析的一种基本方法,产生的信息归因于特征基团的存在,如醇类、酮类、烯类等,获得的光谱代表了每个测试样品的化学指纹。刘晶晶等[23]采用傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR) 结合二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱分析方法,通过比较峰数、峰形和峰的强度能够辨别出松贝、青贝、炉贝和太白贝母。王月[24]采用FTIR和反射光纤探针,对不同种类的贝母进行检测,并通过主成分分析和聚类分析,利用软独立建模分类法(soft independent modeling of class analogies,SIMCA算法)的监督模式识别出掺假的川贝母粉末。范林宏等[25]利用便携式近红外光谱仪采集川贝母真伪品近红外光谱数据,利用线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)及偏最小二乘法(partial least squares,PLS)分别建立川贝母-掺伪品、不同类别掺伪品定性校正模型及不同类别掺伪品掺伪量定量校正模型,其中运用的2种模型预测的准确率分别为83.33%、90.91%。便携式近红外光谱仪虽然模型参数不够完善,可能没有台式设备精确,但有较强的实时检测功能,可用于大批量川贝母的无损鉴别,为川贝母采收和交易环节的质量评价提供一定的参考[25]。此外,王文娜等[26]采用激光拉曼光谱技术测定了川贝母及其伪品表面的拉曼光谱,利用拉曼光谱可快速、无损地鉴别川贝母真伪品。

4 分子生物学方法鉴别

4.1 碱裂法

碱裂法是利用染色体脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)与质粒DNA变性复性的差异来分离染色体DNA与质粒DNA[27]。碱裂法是使质粒DNA和染色体DNA在高pH下变性,同时沉淀蛋白质,再将pH值调至中性,由于质粒DNA相比染色体DNA较小,容易复性成双链,而染色体DNA较大,易缠结成网状不溶物质,可通过离心除去[27]。陈玉秀等[27]研究表明,含有200 mmol·L-1氯化钠(NaCl)溶液,5 mmol·L-1氯化镁(MgCl2)溶液,体积分数1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),体积分数1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP),2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA),10 g·L-1十二烷基硫酸钠(SDS),0.1 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)的碱裂解液有最佳的DNA提取效果,这种方法成本较低,可用于快速鉴别川贝母的真伪。

4.2 聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction,PCR法)

PCR法是一种DNA体外快速扩增技术,微量和常量样品都可以使用这种技术。荧光定量PCR法可分为探针法和染料法,其中探针法的特异性、灵敏度和重复性都明显优于染料法,同时有定性和定量的作用,可用于鉴别川贝母掺伪情况[28]。杨健等[29-30]采用了实时荧光定量PCR法,利用川贝母内转录间隔区1(internal transcribed spacer1,ITS1)序列的特点,设计了真、伪川贝母鉴别引物,真川贝母鉴别引物以川贝母ITS1区第75位碱基“C”为3′末端,伪川贝母鉴别引物以“T”为3′末端,该方法可以检测川贝母粉末的掺伪程度。刘艳艳等[31]建立了多重荧光实时定量法鉴别川贝母真伪品。刘香香等[32]也分析了川贝母ITS1序列特点,设计了1对川贝母特异性扩增引物(CBM-SP引物),建立了PCR法用来快速鉴别川贝母真伪品,鉴别结果与药典收录的限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,PCR-RFLP)一致。陈慕媛等[33]设计了川贝母DNA特异性引物,结果表明,川贝母溶解曲线是尖锐的峰形,退火温度是80.98 ℃,利用这种特异的熔解曲线峰形和退火温度可区别出川贝母真伪品。潘杰等[34]根据川贝母和伊贝母ITS1片段的一个特异性位点设计了双杂交探针,因为该探针与PCR扩增片段杂交程度不同,所以仪器在不同退火温度下检测的荧光峰值存在差异,由此来区别出川贝母和伊贝母,这种方法可用于鉴别川贝母中是否掺杂伊贝母。

4.3 PCR-RFLP法

川贝母内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)含有CCCGGG序列,它的第75位碱基为C,是限制性内切酶(SmaI)酶切位点,而其他贝母ITS区是CTCGGG序列,第75位碱基为T,不是SmaI酶切位点[35-38]。PCR-RFLP法基于此特点可以实现从分子水平上鉴别川贝母[39]。赵仲麟等[36]对《中国药典》已经有的PCR-RFLP方法进行了改进,设计了7个底物浓度梯度,进行比较后选择了最合适的酶切反应底物浓度,优化了《中国药典》中的酶切体系。这种方法可以检测出川贝母药材的真伪,还可以相对定量检测出川贝母中掺假的量。鲍方名等[40]也优化了《中国药典》上已经有的PCR-RFLP方法,调整了聚合酶链式反应模板和引物的比率,提高退火温度至61 ℃,采用乙醇沉淀法纯化PCR反应液,优化后的方法酶切结果与药典上的原方法酶切结果比较更加清晰,此法也可用于川贝母的真伪品鉴别。孙丽媛等[35]研制了川贝母DNA检测试剂盒,利用该试剂盒提取出川贝母DNA,然后进行PCR反应和RFLP鉴定,使用该试剂盒按照药典的PCR-RFLP法鉴别川贝母真伪操作比较简单,结果差别不大。

4.4 DNA条形码

DNA条形码是利用DNA区域片段进行物种鉴定的技术。对于贝母来说,它的通用条形码鉴别贝母物种真伪的能力较差。HUANG J等[41-42]研究利用叶绿体全基因组序列作为超级条形码,对贝母及其伪品的植物源进行了鉴定,比较了DNA条形码、超级DNA条形码、特异DNA条形码鉴别贝母真伪品的能力,发现超级DNA条形码有较强的鉴别贝母真伪品的能力。虽然超级条形码有很多优点,但在DNA提取困难的情况下,不适合用于植物种类鉴定。对于干燥、煮熟或煎煮的药材,DNA降解严重的情况下,可能提取不到足够的DNA片段[43]。而且与单位点条形码相比,超级条形码的成本更高,并且使用Windows软件进行数据分析也很复杂。当传统的DNA条形码局限于某些亲缘关系较近的物种的植物鉴定时,超级条形码就能显示出它的优势。

4.5 DNA条形码和高效液相指纹图谱相结合的方法

罗焜等[44-45]研究发现,川贝母及其混伪品的内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2, ITS2)二级结构都存在4个螺旋区域,各螺旋上的茎环以及彼此间的夹角存在明显的不同,说明ITS2二级结构有助于更直观地鉴定物种。WU L等[46-48]利用DNA条形码数据的ITS和ITS2成功地鉴定了5种贝母鳞茎,并区分出了这些贝母鳞茎的物种起源。此外,还利用高效液相指纹图谱和分级聚类分析的方法对贝母进行了分类。朱海兰等[49-50]根据川贝母及其伪品的ITS1序列设计了多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)探针对,经MLPA-高分辨率熔解曲线法(high resolution melting analysis,HRM) (MLPA-HRM)实验变性、杂交、连接、实时荧光扩增及熔解过程,利用HRM图鉴别川贝母真伪品,该探针特异性良好,灵敏度高,重复性好,混合样品分析表明,在一次MLPA-HRM反应中,可以检测到掺10%伪品的川贝母。

4.6 荧光-环状等温扩增技术

环状等温扩增技术是一种核酸序列扩增技术,它通过识别靶DNA上特定区域的引物和聚合酶,在恒温条件下高效扩增靶标序列。兰青阔等[51]利用荧光-环状等温扩增技术设计了5套川贝母引物,筛选出川贝母环状等温扩增鉴别引物,用这种引物建立了川贝母环状等温扩增技术鉴别真伪的方法,经验证此方法特异性和灵敏度均较好,可用于川贝母真伪品的快速筛查。

4.7 单核苷酸多态性位点鉴别技术

基因组DNA序列中由单个核苷酸(A, T, C和G)的突变而引起的多态性即为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)[52]。兰青阔等[53]搜集了川贝母的叶绿体基因组序列,并将这些序列中的单核苷酸多态性位点与其他贝母属植物的叶绿体基因组序列中的单核苷酸多态性位点进行比较,结果发现,可用于鉴别川贝母真伪的单核苷酸多态性位点71个,筛选出双等位基因型单核苷酸多态性位点50个,可用于川贝母掺伪的定量分析。

5 计算机辅助鉴别

WANG Z等[54-55]结合了质谱技术和最小乘回归分析的方法来鉴别川贝母真伪品。胡科[12]建立了松贝母、青贝母、平贝母的图像标准数据集,这些图像数据集由4个不同视角拍摄的图片组成,并利用传统的机器学习算法支持向量机作为贝母图像分类器对贝母图像进行鉴别和分类。吴冲等[56]通过建立川贝母的图像数据库,获取川贝母的外在视觉特征,利用计算机视觉技术和深度学习算法实现了对川贝母的鉴别。这种深度学习算法技术存在的问题是对于视觉特征差异比较小的川贝母真伪品,可能出现鉴别错误,如果重点关注真伪品特征性的差别,将有利于提高鉴别的准确度。郭凤柳等[57]利用气相色谱离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技术得到川贝母、平贝母、伊贝母的指纹图谱,计算出挥发性物质含量,采用主成分分析(principal component analysis, PCA)对不同贝母所含挥发性物质的量进行比较,结果发现,松贝、炉贝和青贝这3个品种样品中都含有较多相似的挥发性物质,但这些挥发性成分在平贝母和伊贝母样品中含量很低或者没有,此法可用于区分出川贝母和平贝母、伊贝母。

此外,张慧杰等[58]采用电子舌技术提取川贝母味觉信息值,结合化学计量学建立辨识模式,鉴别川贝母饮片真伪,此方法鉴别速度比药典快,但鉴别准确率较传统经验低。杨诗龙[59]采用了电子舌和电子鼻技术对川贝母真伪品粉末进行了鉴别,发现效果较好。刘瑞新等[60]采用了电子眼技术对川贝母饮片真伪品进行了鉴别,该方法鉴别结果比药典更快速、准确。

6 小结与展望

川贝母源自多种贝母,这些物种由于形态存在相似性及复杂的变异很容易混淆,单从形态上区分并不容易,因此,采用快速、准确的方法鉴别很重要。目前市场对川贝母的需求越来越大,市场上仍然存在一些川贝母的掺假现象。如今已有许多研究集中在不同贝母物种的鉴别上,但鉴定含川贝母产品原料药的方法很少。未来应改进已有的一些鉴别分析技术,提高鉴别川贝母的准确性和有效性。此外,还要考虑新的鉴别方法,如红外和拉曼光谱等,这些方法耗时较少,对环境友好,鉴别结果准确性高。