刘铄菲， 唐年初， 徐德平

(江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)

牛膝（Achyranthes bidentata）为多年生草本植物，属苋科植物，广泛分布于河南、山东、四川等地[1]。牛膝是保健食品生产原料，在河南焦作一带用作煲汤滋补佳品[2]，主要成分有多糖、皂苷、蜕皮甾酮、黄酮类和生物碱类等[3-4]，具有多种药理活性，如消炎镇痛、抗骨质疏松、免疫调节等。 现代药理研究发现牛膝具有降血糖活性[5]，成为中药降血糖方剂的高频用药，牛膝中具有降血糖活性的成分多指向多糖类物质，如牛膝粗多糖对血脂代谢的改善作用[6]、牛膝粗多糖对糖尿病模型小鼠和大鼠的降血糖作用[7-8]，以及在高脂饲料中， 随着牛膝粗多糖添加量的增加，血鹦鹉的血糖含量显著降低，表现出降血糖作用等[9]，但有关牛膝多糖构成与降血糖活性的关系鲜有报道。

牛膝多糖的降血糖活性研究不应仅仅局限在粗提物的活性上，应深入研究牛膝多糖降血糖作用的构效关系，为揭示牛膝降血糖机制和开发利用提供理论依据。 因此，作者以牛膝为原料，通过水提醇沉法以及多种柱层析手段对牛膝多糖进行提取与纯化[10]，结合动物实验检测降血糖活性，筛选出牛膝中具有降血糖活性的多糖，为明确其在糖尿病治疗方面的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛膝： 购自亳州药材市场， 经鉴定为怀牛膝（Achyranthes bidentata）；硅胶板：山东烟台芝罘化工厂产品；DEAE-Cellulose 色谱柱、HW-55F 色谱柱、G-5000 PWXL 凝胶柱、G-3000 PWXL 凝胶柱：日本TOSOH 公司产品；Sephacry S-400 色谱柱：美国GE Healthcare 公司产 品；Sephadex G-100 色谱柱： 瑞典Pharmaeia 公司产品； 链脲佐菌素（streptozocin，STZ）： 美国Sigma 公司产品 （批号：SLCF1289）；SPF 级雄性ICR 小鼠：浙江维通利华实验动物技术有限公司提供 （ 合格证号：20201204Abzz0619000862）； 实验用水为去离子水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

RAT-100 型萃取罐：无锡申科仪器有限公司产品；R-1002 型旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司产品；SYB206-100 型恒流泵：天津市科器高新技术公司产品；UV-2450 型紫外分光光度计： 日本岛津公司产品；Avance 500 MHz 型核磁共振仪：美国Bruker 公司产品；Voyager-DE PRO 型质谱仪：美国ABI 公司产品；TRACE 1300 型气相色谱仪：赛默飞世尔科技公司产品；卓越金采型血糖测定仪及试纸：上海罗氏制药有限公司产品；AU5800 全自动生化分析仪：美国贝克曼库尔特有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 牛膝各组分的提取与粗分离 称取10 kg 牛膝，粉碎后置于100 L 萃取罐中，按照料液比1 g∶10 mL加入体积分数为75%的乙醇，60 ℃搅拌提取3 h，过滤，取滤液，滤渣按照上述方法重复提取一次，合并两次滤液进行减压浓缩得到醇提物。 滤渣继续按照料液比1 g∶10 mL 加入去离子水， 相同条件下搅拌提取两次， 合并滤液减压浓缩得到牛膝水提液，向水提液中边搅拌边加入3 倍体积的无水乙醇，静置8 h 后过滤得到水提醇沉物和水提醇溶物。

另取500 g 牛膝， 粉碎后置于10 L 萃取罐中，按照料液比1 g∶10 mL 加入体积分数为75%的乙醇，60 ℃旋转提取3 h，过滤，取出醇提液后，滤渣按照料液比1 g∶10 mL 加入去离子水， 相同条件下得到水提液，将水提液和醇提液合并浓缩至干，即得到牛膝原样。

1.3.2 牛膝提取物降血糖活性测定

1）STZ 溶液的配制 参照段晖等的方法[11]，准确称取2.10 g 柠檬酸， 加入100 mL 双蒸水配成柠檬酸母液，称为A 液；准确称取2.94 g 柠檬酸三钠，加入100 mL 双蒸水配成柠檬酸钠母液，称为B 液。将A、B 液按体积比1.00∶1.32 混合， 用pH 计测定pH，调溶液pH 为4.0，得到0.1 mol/L 柠檬酸钠缓冲液。 准确称取300 mg STZ 溶于30 mL 柠檬酸钠缓冲液中， 新鲜配制成10 mg/mL 的STZ 溶液， 并用0.22 μm 滤菌器过滤除菌，注意避光配制，现用现配。

2）糖尿病模型的建立与分组 取5 周龄SPF级ICR 雄性健康小鼠80 只， 适应性喂养7 d 后禁食12 h，随机取70 只小鼠按照150 mg/kg 剂量腹腔注射STZ 溶液， 余下10 只小鼠注射相同剂量的柠檬酸钠缓冲液，记为空白组。 3 d 后，用血糖仪检测各组小鼠空腹血糖， 空腹血糖高于11.2 mmol/L 即认为糖尿病模型建造成功[12]。

选造模成功的小鼠50 只，分为模型组、原样组（A）、水提醇沉组（B）、水提醇溶组（C）、醇提组（D），每组10 只。 分别取适量分离组分用去离子水配制成0.1 g/mL 的样品溶液，各给药组按照1.0 g/（kg·d）剂量[13-14]灌胃相应的组分，模型组与空白组则灌胃饮用水，连续灌胃8 周。

每周记录一次各组小鼠进食量、饮水量及体质量，并对小鼠毛色、尿量、精神状态等一般情况进行观察。 给药前、给药第4 周和第8 周测定小鼠空腹血糖。 给药8 周后，对小鼠摘眼球采血，室温静置2 h 后于4 ℃下3 000 r/min 离心15 min 提取血清，用全自动生化分析仪测定HbA1c， 同时取小鼠肝、肾称质量，计算肝脏系数和肾脏系数。

1.3.3 水提醇沉组分的分离 取水提醇沉组分，加入适量的去离子水至适宜体积， 上样至DEAE 柱（5 cm×100 cm），流量恒定为5 mL/min，分别用去离子水和0.05、0.10 mol/L 的NaCl 溶液洗脱， 自动收集器收集洗脱液， 每管10 mL。 采用苯酚硫酸法检测，根据洗脱峰分别收集水洗脱液（M）和盐洗脱液，由于盐洗脱部分中糖组分极少，不足以支撑后续的分离，无法进一步研究。

取适量水洗脱液， 浓缩之后上样到HW-55F（5 cm×150 cm）色谱柱上，用去离子水以5 mL/min的流量洗脱，每管10 mL，收集洗脱液。 采用苯酚硫酸法检测洗脱组分， 得到洗脱组分M1、M2、M3，经多次分离后得到用于动物实验的各组分的量。

1.3.4 HW-55F 柱水洗脱组分降血糖活性检测按照1.3.2 的方法建立小鼠糖尿病模型， 测定M1、M2、M3 组分的降血糖活性。

1.3.5 活性组分的纯化 将具有降血糖活性的M2组分上样至Sephacryl S-400 凝胶色谱柱 （3 cm×150 cm），继续用去离子水以2 mL/min 的流量洗脱。采用苯酚硫酸法检测洗脱组分，收集主要组分并反复上此柱分离， 直到洗脱峰为单一对称峰为止，最后得单一组分N。

1.3.6 多糖N 的纯度鉴定 将具有降血糖活性的多糖N 用去离子水配制成质量浓度为5 mg/mL 的溶液， 使用紫外分光光度计在波长200~400 nm 进行扫描，检测其是否含有蛋白质吸收峰。 另取适量多糖N 溶液上样至Sephadex G-100 凝胶色谱柱（3 cm×150 cm）， 用去离子水以2 mL/min 的流量洗脱。 采用苯酚硫酸法测定洗脱液，以确定是否为单一峰。

1.3.7 多糖N 的单糖组成分析 按刘冰等的方法[15]，称取20 mg 多糖N， 加入2 mL 1 mol/L 的硫酸，在安培管中用沸水浴水解5 h，取出冷却后，水解液用BaCO3固体中和至pH 为7，离心取上清液备用。

将上述上清液移至具塞试管中，加入10 mg 盐酸羟胺、适量肌醇和0.5 mL 无水吡啶溶解，加塞，90 ℃恒温水浴振荡30 min； 冷却至室温后， 加入0.5 mL 乙酸酐，加塞，90 ℃恒温水浴振荡30 min，冷却至室温，即得单糖乙酰化衍生物。 取6 种标准单糖：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖各10 mg，按上述方法制备乙酰化衍生物。

将1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化样品进行气相色谱分析， 参数如下：DB-1701 石英毛细管色谱柱 （0.53 mm×30 m×1.5 μm）； 检测器：FID（氢火焰离子化检测器）；柱温采用程序升温，起始温度为120 ℃，停留2 min 后，以10 ℃/min 升温至195 ℃，停留1 min 后，以3 ℃/min 升温至240 ℃，停留10 min。

1.3.8 多糖N 的相对分子质量测定 从色谱洗脱曲线中可知多糖N 的保留时间较长，说明多糖N 的相对分子质量较小，取多糖N 直接进行质谱分析[16]，测定相对分子质量。

1.3.9 多糖N 的核磁共振测定 多糖N 先进行重水（D2O）交换二次，再以重水为溶剂，进行1H-NMR和13C-NMR 等分析。

1.3.10 数据处理 数据采用SPSS 26.0 统计学软件分析，结果以平均值±标准差表示。 组间比较采用方差齐性检验，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 牛膝提取物不同组分降血糖活性

与空白组相比，模型小鼠毛发干枯暗淡、精神不佳、垫料湿脏，出现明显的“三多一少”症状（即多饮、多食、多尿和体质量减轻），这是机体在长期高血糖状态下的典型表现[17]，主要是因为血糖过高造成渗透性利尿，导致“多尿”，进而引起口渴多饮，又因营养物质流失而出现多食却消瘦的现象。 各组小鼠进食量、饮水量与体质量变化见图1~图3，前28 d 各给药组小鼠“三多一少”症状与模型组类似，随着给药的进行，后28 d 有不同程度的改善，其中B组小鼠“三多一少”症状改善最为明显。

图1 各组小鼠进食量变化Fig. 1 Changes in food intake of mice in each group

图2 各组小鼠饮水量变化Fig. 2 Changes in water consumption of mice in each group

图3 各组小鼠体质量变化Fig. 3 Changes in body weight of mice in each group

糖尿病的“三多一少”症状，在中医理论中被称作“消渴症”，由淤血阻络、热毒内盛、伤阴耗气等所致，因此选用的治疗药物多为活血化瘀、清热解毒及补益类中草药[18]，牛膝也正是因为具有以上功效而被用于治疗糖尿病。 根据小鼠“三多一少”症状的定量分析，活性组分主要存在于牛膝水提醇沉物中。

各组小鼠肝脏系数、肾脏系数见表1。模型组肝脏系数和肾脏系数明显高于空白组， 异常肥大，A组、B 组和D 组的肝脏系数和肾脏系数相比于模型组显著降低（P＜0.05），与空白组接近，趋于正常，表明牛膝原样、水提醇沉物和醇提物可缓解糖尿病小鼠肝、肾病理性肥大。 糖尿病小鼠在持续高血糖状态下会出现肝、肾病变，如异常的血脂代谢诱发肝硬化、脂肪肝等，肾小球基底膜增厚，系膜扩张，出现肾小球硬化和肾小管间质性纤维化等病理改变，导致肝脏、肾脏等脏器出现异常肥大[7]。 从各组小鼠肝脏系数、肾脏系数的比较结果上可以看出，牛膝原样、牛膝水提醇沉物和醇提物均具有缓解脏器肥大的作用。

表1 肾脏系数和肝脏系数Table 1 Kidney and liver weight indexs

各组分对小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白的影响见表2。给药前，模型组小鼠和各给药组小鼠之间的空腹血糖无显著性差异， 均高于空白组小鼠，说明糖尿病小鼠造模成功。 在给药第4 周，与模型组相比，B 组小鼠血糖明显下降； 在给药第8 周，B 组小鼠血糖比模型组显著降低（P＜0.05），具有降血糖作用。A 组小鼠在第8 周仍为高血糖状态，与模型组无差异，而牛膝经过水提醇沉得到的B 组样品才表现出降血糖功效，出现这一结果的原因可能是经过提取分离，B 组分富集了降血糖活性成分，故在相同给药剂量下，B 组表现出优于A 组的降血糖效果。

表2 牛膝各组分对小鼠FPG 和HbA1c 的影响（n=10）Table 2 Effects of various components of Achyranthes bidentata on FBG and HbA1c in mice（n=10）

HbA1c 是由红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类发生非酶反应所产生的产物，其测定结果与检测前是否空腹、是否注射胰岛素、是否服用降糖药物等因素无关[19]，故比空腹血糖更能准确反应机体血糖水平。 在第8 周时，B 组小鼠的HbA1c 显著低于模型组（P＜0.05），进一步证明牛膝水提醇沉物具有降血糖效果。

从以上结果可以看出，牛膝不同组分具有降血糖的作用，其中牛膝醇提物与水提醇沉物均具有缓解糖尿病小鼠脏器病变的效果，水提醇沉物同时具有降血糖活性。

2.2 牛膝水提醇沉组分的分离结果

牛膝水提醇沉物经DEAE 柱分离，其洗脱曲线如图4 所示。 水洗脱有一个主峰，而NaCl 溶液洗脱只有一个很小的洗脱峰，表明水提醇沉物中多糖主要在水洗脱部分，进一步得出牛膝多糖以中性多糖为主，收集水洗脱物浓缩到适当体积。

图4 DEAE 纤维素柱洗脱曲线Fig. 4 Elution curve of DEAE cellulose column

将水洗脱物用HW-55F 凝胶色谱柱继续用水洗脱分离，其洗脱曲线见图5。有3 个不同保留时间的洗脱峰，依照洗脱顺序分别记为M1、M2、M3。 从保留时间判断，3 个洗脱组分的相对分子质量以M1为最大，M2 介于中间，M3 最小。

图5 HW-55F 凝胶柱洗脱曲线Fig. 5 Elution curve of HW-55F gel column

2.3 M1、M2、M3 组分降血糖活性检测

将给药3 个组分的小鼠分为M1 组、M2 组、M3组，3 个组分对小鼠FPG 和HbA1c 的影响见表3。在给药第4 周，M2 组小鼠的FPG 呈下降趋势，在给药第8 周，M2 组小鼠的FPG 和HbA1c 均显著低于模型组（P＜0.05），由此可得M2 组分具有降血糖活性，而M1、M3 组分没有该活性。 牛膝多糖中具有降血糖活性的组分主要为中等相对分子质量的M2，而大相对分子质量和小相对分子质量的组分都没有该活性。

表3 M1、M2、M3 组分对小鼠FPG 和HbA1c 的影响（n=10）Table 3 Effects of components M1，M2 and M3 on FPG and HbA1c in mice（n=10）

2.4 活性组分的纯化

具有降血糖活性的M2 组分反复经Sephacryl S-400 凝胶色谱柱纯化，直到洗脱峰为单一对称峰，其洗脱曲线如图6 所示，结果表明得到了一个单一多糖，记为N。

图6 Sephacryl S-400 凝胶柱洗脱曲线Fig. 6 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column

2.5 多糖N 的结构分析

2.5.1 纯度鉴定 多糖N 经过Sephadex G-100（3 cm×150 cm）凝胶色谱柱洗脱，其洗脱曲线如图7所示。 从图中看到也为单一对称峰。 另外，在260~280 nm 下检测时无紫外吸收峰，表明N 为纯多糖。

图7 Sephadex G-100 凝胶柱洗脱曲线Fig. 7 Elution curve of Sephadex G-100 gel column

2.5.2 单糖组成分析 多糖N 水解经乙酰化后气相色谱结果只看到一个峰，经与标准品对比，与葡萄糖峰一致，说明多糖N 含有葡萄糖残基。 结合核磁分析多糖N 含有果糖， 由于酮糖不易进行衍生化，实验中使用的PMP 柱前衍生化法无法检测出果糖，而未呈现果糖的色谱峰。

2.5.3 相对分子质量测定结果 多糖N 的质谱如图8 所示，分子离子峰（[M-H]-）质荷比为1 800.5，确定该多糖N 相对分子质量为1 801.5， 每组系列峰中相邻两峰之间的m/z 均相差162， 表明多糖的糖残基单元为己糖，即多糖N 由11 个糖残基组成，说明N 的相对分子质量较小，这与前面的结果一致。

图8 多糖N 的TOF-MS ES 图谱Fig. 8 TOF-MS ES spectra of polysaccharide N

2.5.4 核磁共振分析 多糖N 为白色无定形粉末， 其1H-NMR 谱、13C-NMR 谱、135DEPT 谱见图9、图10、图11。1H-NMR 图谱中仅在δ 为5.290 处有一弱信号，为糖上的端基H 信号，δ 为4.780 处是重水残存的信号峰，δ 为3.371~4.077 处的信号峰为糖上 的 端 基H 信 号。 在13C-NMR 图 谱 中，δ 为103.037~104.067 处有3 组糖端基的碳信号，而1HNMR 谱无相应的端基H 信号， 说明多糖中是以酮糖为主要组成单元， 结合135DEPT 谱可见δ 为63.210~59.854 处都是CH2上的碳信号，从化学位移进一步分析得出这些酮糖为果糖，有3 个果糖残基且都为β 构型。 碳谱中还存在一组弱的碳信号，分别 在 δ 为 92.367、76.162、75.066、72.491、70.984、61.141 处，这是一组葡萄糖信号，从δ 为92.367 处的化学位移信号来看，葡萄糖为α-构型。从丰度看δ为103.037 处的碳信号与δ 为92.367 处的碳信号接近，可以判断该果糖残基与葡萄糖相连，葡萄糖中其他碳并未成键，说明葡萄糖是该多糖的起点。δ 为81.007 和80.147 处的碳信号应为果糖C3、C5的碳信号， 果糖之间是以β-1，2 糖苷键连接构成主链，并在C6位上形成侧链。 该结构（见图12）与王昌盛报道的牛膝果聚糖完全一致[20]。

图9 多糖N 的 1H-NMR 图谱Fig. 9 1H-NMR spectrum of polysaccharide N

图10 多糖N 的13C-NMR 图谱Fig. 10 13C-NMR spectrum of polysaccharide N

图11 多糖N 的135DEPT 图谱Fig. 11 135DEPT spectrum of polysaccharide N

图12 牛膝多糖N 结构式Fig. 12 Structural formula of polysaccharide N from Achyranthes bidentata

3 结 语

通过STZ 诱导糖尿病小鼠实验，筛选出牛膝中具有降血糖活性的多糖，并经分离纯化，鉴定多糖构成。

经STZ 诱导糖尿病小鼠实验证明水提醇沉物具有降血糖活性。 水提醇沉物经DEAE-Cellulose、HW-55F 分离， 得到相对分子质量不同的3 个组分，经动物实验得出中等相对分子质量的多糖具有降血糖活性。

作者将该活性组分经Sephacryl S-400 凝胶柱进一步纯化，得到单一多糖N。在紫外分光光度计下鉴定不含蛋白质。经Sephadex G-100 凝胶柱鉴定为均一多糖， 经质谱测定相对分子质量为1801.5，该多糖由1 分子葡萄糖和10 分子果糖组成， 以葡萄糖分子为起点，与果糖C2相连，果糖之间以β-1，2糖苷键连接形成主链，支链连接在果糖的C6上。 经STZ 诱导糖尿病小鼠实验证明其具有降血糖活性，是牛膝发挥降血糖作用的主要成分。