刘梦达 综述 冯红超，闫明 审校

1.遵义医科大学口腔医学院，贵州 遵义 563000；2.贵阳市口腔医院，贵州 贵阳 550002；3.遵义医科大学，贵州 遵义 563000

外伤、肿瘤、炎症及先天性疾病是导致口腔颌面部骨缺损的主要原因，对患者的身心健康都可造成严重影响，而传统的骨移植修复技术存在二次创伤、术后感染、愈合延迟和免疫排斥反应等问题，难以完全恢复患者缺损部位的结构和功能。随着再生医学研究不断发展，现可通过组织工程手段修复颌骨缺损，并恢复颌面部结构和功能[1]，牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)可分化为成骨细胞、神经样细胞、软骨细胞、成血管内皮细胞等，具有取材方便、创伤小、来源广泛、免疫原性较低、可长期冻存等优点[2]，成为骨组织工程的重要种子细胞。植物雌激素是一类可发挥雌激素样作用的天然化合物，可通过多种途径上调成骨细胞活性，研究发现多种植物雌激素对DPSCs有促增殖与成骨分化的作用，本文就目前植物雌激素调控DPSCs成骨分化的研究进展综述如下：

1 DPSCs

DPSCs表现出与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)相似的特征，包括克隆形成和自我更新能力[3]，具有较好的增殖潜力，又能多系分化，产生不同的细胞谱系，具有成骨、软骨、成脂、神经和肌肉生成的潜能，以及很高的矿化潜力[4]。DPSCs具有取材方便、创伤小等优点，它们的冷冻保存能力是另一个主要优势，使它们能够更方便地获取[5]，非常适合作为种子细胞应用于组织工程。

2 植物雌激素

一系列科学研究表明，雌激素通过调节多种信号分子或与其他信号通路相互作用来调节骨代谢。植物雌激素是一类从植物、水果和蔬菜中提取，结构和生物活性均类似于雌激素的非甾体类化合物，主要有三类：异黄酮类、木脂素类和香豆素类，具有弱雌激素活性，与雌激素的作用相似，可与细胞上的雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合，发挥激动剂、拮抗剂作用[6]。植物雌激素可与破骨细胞的雌激素受体结合，抑制破骨细胞的活性；当与成骨细胞的雌激素受体结合时,可诱导细胞释放成骨相关因子，增强成骨细胞的活性，促进骨质生长，加速骨形成[7]，广泛应用于绝经后妇女骨质疏松的雌激素替代疗法(ERT)，优势在于治疗和预防绝经后女性骨质流失的同时，避免发生ERT的并发症[8]。

2.1 鹰嘴豆芽素A(biochanin A，BCA) BCA 主要来源于大豆类植物鹰嘴豆的胚芽，属于一种异黄酮类化合物，是红车轴草的主要效力来源，具有保护神经、抗炎、抗感染、抗癌、抗氧化、保肝以及类雌激素等多种药理作用[9]，研究证明BMSCs经BCA处理可增强矿化活性，刺激成骨标记基因碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(osteocalcin，OCN)的表达，诱导Runt 相关转录因子2 (Runx2)、护骨素(OPG)和Ras 同源基因家族成员A(RhoA)蛋白的表达，增强间充质干细胞成骨分化能力，调节骨形成[10]。同时BAC 治疗可抑制炎症反应，调节不平衡的氧化应激反应，改善牙槽骨丢失[11]；Liao等[12]研究发现，BCA 通过下调破骨细胞相关基因TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-1α(白介素1-α)和IL-1β(白介素1β)的分泌水平，有效地抑制破骨细胞的形成，降低羟基磷灰石的吸收，进一步的机制分析表明，这期间BCA 抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路，包括MAPKs通路中的主要3 条通路：p38 通路、细胞外信号调节激酶(ERK)通路以及c-Jun氨基末端激酶通路(JNK)，同时BCA还抑制了核因子-κB(NF-κB)信号通路，从而下调破骨细胞基因表达。在去卵巢(OVX)大鼠模型中，BCA在体外诱导前成骨细胞分化为成骨细胞，并增加成骨细胞矿化，同时抑制破骨细胞的增殖，Su 等[13]进一步研究发现，BCA 或17β-雌二醇(E2)治疗均可抑制去卵巢大鼠尿脱氧吡啶酚、血清TNF-α和IL-1α的升高，提示BCA抑制破骨细胞活性的作用可能与雌激素信号通路有关。谢昕儒等[14]最新研究中，蛋白免疫印迹实验显示，10 μmol/L BCA通过激活P38/MAPK 信号通路，显著提升p38 的磷酸化水平，提高成骨标志基因ALP、Ⅰ型胶原(type I Collagen，COL-1)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、OCN的表达水平，从而促进人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)成骨向分化。

2.2 大豆苷元(daidzein，DD) 大豆苷元(DD)又称黄豆苷元，是一种天然的异黄酮类物质，广泛存在于豆科类植物，尤其在大豆中含量较高，是大豆异黄酮的主要效力成分。作为一种植物雌激素，DD 具有类似雌二醇的结构，对骨质疏松症具有保骨作用。王川等[15]最新研究发现，DD 促进人成骨样MG-63 细胞OPG的mRNA和蛋白表达的同时，还抑制了核因子ⅠκB 受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factorⅠκB ligand，RANKL)的mRNA 和蛋白的表达，改善骨吸收症状，雌激素受体(ER)阻断剂ICI 182780可拮抗该作用，提示DD可能通过与ER结合来促进OPG以及抑制RANKL的表达，进一步研究发现DD促进细胞成骨的作用是由ERα和ERβ共同介导的；王志平等[16]研究发现DD 不仅刺激MG-63 细胞增殖，还通过增强MG-63 细胞经典的雌激素反应元件(estrogen response element，ERE)的基因转录活性，发挥促进细胞成骨的作用，其机制可能与升高ERα、ERβ及其相关的类固醇受体共激活因子(steroid receptor coactivator，SRC-1)的表达水平有关。Jin 等[17]研究显示DD 通过增加ALP 活性和胶原蛋白含量来促进人成骨细胞样MG-63 细胞分化，与ER 拮抗剂ICI 182780 共同处理可防止此作用，验证了DD通过ER依赖的信号通路刺激成骨这一假设，其机制还可能与丝裂原激活的蛋白激酶/细胞外调节激酶(MEK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的激活有关。武斌等[18]的研究初步证实一定浓度(0.1 μmol/L)的DD可促进人乳牙牙髓干细胞(SHEDs)的增殖，同时DD呈剂量依赖性地调高ALP 和OCN 的基因和蛋白表达，进一步检测发现其促进SHEDs 成骨的机制还可能与提高转化生长因子-β(TGFⅠβ)的表达有关。

2.3 槲皮素(quercetin) 槲皮素属于黄酮类化合物，主要来源于蜂胶，具有多种临床功效，能发挥较强的抗炎、抗感染、抗氧化、抗病毒以及免疫调节的作用，对骨代谢也具有积极的药理作用。Pang 等[19]研究结果显示，槲皮素能显著促进小鼠BMSCs 的增殖、ALP 活性和细胞外基质的生成及矿化，qPCR 及Western blotting 结果表明，槲皮素促进骨形态发生蛋白2(BMP2)、Smad1、Smad4、RUNX2、成骨细胞特异性转录因子(osterix，OSX)的表达和Smad1的磷酸化，用ER抑制剂ICI182780 处理可阻断槲皮素的这些作用，提示槲皮素通过与ER相互作用刺激BMP 信号转导，导致下游转录因子RUNX2 和OSX 的表达增加，最终刺激BMSCs 分化和矿化。Li 等[20]在研究槲皮素对大鼠BMSCs成骨分化中MAPK信号通路的影响实验中发现，10 μmol/L 槲皮素处理组p38MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平和ALP、COL-I、骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BGP)的蛋白表达水平以及TGF-β1、BMP-2 和核心结合因子α1(CBF-α1)的mNRA 表达水平升高最明显，而SP600125 (JNK 抑制剂)和PD98059 (ERK1/2 抑制剂)的加入可以显著拮抗这些成骨作用，证明槲皮素通过激活MAPK信号通路促进BMSCs的成骨分化，其中ERK1/2 和JNK 信号通路是其中主要途径。Wei 等[21]在骨内植入物骨整合研究中发现，槲皮素对促进大鼠BMSCs 成骨分化、抵抗多种病原体和降低炎症活性具有显著的增强作用，较强的抗炎、抗菌能力让其可作为药物输送系统促进炎症植入部位骨整合的关键药物，抵抗多种病原体，减少炎症活动。Zhang 等[22]研究发现，槲皮素独特的抗炎作用还体现在通过抑制NF-κB/NLRP3 通路，显著减弱了TNF-α诱导的炎性hPDLSC 中成骨相关基因和蛋白质表达、碱性磷酸酶(ALP)活性和矿化基质的抑制情况，增强炎性状态下人牙周膜干细胞(hPDLSCs)的成骨分化能力，证明槲皮素或许是治疗牙周炎骨缺损的潜在治疗方法。在组织工程应用方面，Song 等[23]将种植了rBMSCs 的槲皮素/丝素蛋白/羟基磷灰石(Qtn/SF/HAp)支架植入骨缺损部位，结果显示支架与周围组织结合良好，具有良好的细胞相容性，槲皮素在植入过程中有效地促进了rBMSCs 向成骨细胞分化，从而为高性能骨组织再生提供潜在的替代移植物。胡韶光等[24]研究发现，加入槲皮素的人牙髓干细胞(hDPSCs)支架复合体能够起到促进修复兔颅骨缺损作用，提高ALP 的活性水平，增强矿化结节形成，增加BMP2、Runx2、OPN 和OCN等促进成骨基因的表达量，证明槲皮素在人牙髓干细胞的增殖和成骨分化中起重要作用。

2.4 淫羊藿苷(icariin，ICA) 短淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)是一种用于减轻炎症和恢复成骨的中药[25]。ICA是从短尾淫羊藿中提取得到的类黄酮化合物，是其主要有效活性成分，是一种骨代谢相关疾病中的常用药物，临床应用于预防绝经后妇女骨质流失治疗。转录调控因子在终末成骨分化过程中激活Runx2 基因，在BMSCs 成骨分化中起重要作用，Wei 等[26]的研究结果表明ICA(0.1 μmol/L)通过增加TAZ 表达促进rBMSCs 的成骨分化，但ICA 的这些作用可被雌激素受体α抑制剂ICI 182780 或Wnt/β-连环蛋白通路(β-catenin)抑制剂DKK1阻断，提示ICA促进rBMSCs成骨主要是通过ERα和Wnt/β-catenin途径来实现的。而Ho等[27]发现ICA作为一种植物雌激素，在成骨细胞中介导雌激素作用的机制较为独特，可选择性激活非基因组雌激素信号，特别是Akt 磷酸化，从而发挥优越的成骨和抗凋亡作用。Xu 等[28]研究表明，ICA通过抑制Notch信号通路，缓解去卵巢(OVX)小鼠体内骨质疏松，促进成骨分化。这可能与ICA增加小鼠BMSCs的自噬活性来增强细胞成骨分化能力有关[29]。miR-23a-3p是股骨头坏死(ONFH)患者中最显著上调的一类miRNA，而在细胞成骨向分化过程中显著下调，Zhang等[30]研究表明，ICA通过降低miR-23a-3p水平，调节BMP-2/Smad5/Runx2 和Wnt/β-catenin 通路，促进BMSCs 增殖和成骨分化活性并改善ONFH。此外，ICA 还被报道可以显著促进人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和人牙髓干细胞(hDPSCs)的增殖和成骨分化，上调OCN、Runx2 和BMP2 的基因和蛋白表达，促进干细胞的成骨功能活性[31-32]，提示采用ICA 代替常规生长因子应用于骨组织工程具有一定可行性。

2.5 骨碎补总黄酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD) TFDR 是补肾中药骨碎补(rhizoma drynariae)中的主要成分之一，具有抗骨质疏松、骨折和炎症的药理活性，已被证明对骨骼系统具有多方面的药理作用。宋双红[33]将大鼠去卵巢(OVX)构建绝经后骨质疏松模型，实验中TFRD 表现出较强的类雌激素效应，能有效阻止OVX大鼠因雌激素分泌减少引起的骨质疏松和骨质流失，增加OVX 大鼠骨量，并且未刺激大鼠子宫；进一步在细胞和分子水平研究发现，TFRD 可以促进MC3T3-E1 前成骨细胞增殖、成骨分化，形成大量矿化结节，期间明显上调ERα和ERβ蛋白的表达，对OPG 和RANKL 分别表现出促进和抑制作用，提示TFRD可能不仅通过ER信号通路表现出较强的雌激素效应，防止OVX大鼠雌激素缺乏引起的骨量减少，还可以协同OPG/RANKL 信号通路发挥作用，促进成骨细胞活性。Shen等[34]研究发现TFRD可显著提高应激条件下内皮祖细胞(EPC)的血管生成能力和BMSCs的成骨能力，设计阻断PDGF-BB(血小板衍生生长因子-BB)来抑制BMSCs 的成骨分化，而过程中TFRD既改善了BMSCs的成骨抑制作用，又增强其成骨活性，表现为钙结节增多，ALP活性升高，RUNX2和OSX的mRNA和蛋白表达水平升高[35]。黄晓菲等[36]研究发现，通过介导PI3K/Akt信号通路，TFRD还可促进大鼠DPSCs增殖及成骨分化，且表现出浓度和时间依赖性促进成骨效能。Li等[20]研究TFRD在诱导膜技术中对大鼠骨移植物矿化和成骨细胞分化的影响，体内实验表明，TFRD组骨移植物的生长和矿化较好，骨组织中β-catenin、COL1(Ⅰ型胶原)、BMP-2和OPN成骨相关蛋白的表达高于对照组；体外实验表明，TFRD组成骨细胞增殖较快，ALP 活性较高，矿化结节数量较多，但阻断Wnt/β-catenin信号通路会限制这些影响，提示TFRD 能够促进骨移植物的矿化和成骨细胞的分化，这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

2.6 柚皮苷(Naringin) 柚皮苷是从柑橘类水果中提取的主要黄酮类化合物，是中药骨碎补的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗溃疡、抗骨质疏松和抗癌特性[37]，有显著的类雌激素作用，具有促进骨形成的作用。Pang 等[38]发现柚皮苷可防止小鼠卵巢切除术引起的骨质流失，显著诱导ERα的磷酸化，对小鼠成骨细胞功能的刺激作用可通过与雌激素受体拮抗剂ICI182780 共同孵育而被抑制，这提示柚皮苷可能是通过激活非配体依赖的成骨细胞内雌激素受体(ER)来实现促进成骨作用的。Wang等[39]则采用双抗体夹心法测定骨代谢指标，发现柚皮苷通过靶向抑制JAK2/STAT3 信号通路促进BMSCs 的成骨分化，从而改善去卵巢(OVX)诱导的大鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)发展。Liu 等[40]发现柚皮苷在1～100 μg/mL 范围内以剂量依赖性方式增强人羊水干细胞(hAFSCs)的增殖和ALP 活性及钙化含量，OPG、OPN、COL-I、BMP-4、RUNX2、β-catenin和细胞周期蛋白D1的基因表达也显著增加，同时下调RANKL的表达，提示柚皮苷不仅促进成骨细胞分化，也能抑制破骨细胞的形成，通过BMP和Wnt-β-catenin信号通路促进hAFSCs成骨。Guo等[41]使用柚皮苷处理hDPSCs，增强ALP活性和矿化水平，并提高Runx2、OPN、DSPP(牙本质涎磷蛋白)和DMP1(牙本质基质蛋白1)的基因表达，从而促进hDPSCs 的增殖、迁移和成骨，Western 印迹结果显示柚皮苷显著激活hDPSCs的Wnt/β-catenin信号转导通路；Zheng 等[42]进一步研究发现柚皮苷颗粒对hDPSCs 的甘油磷脂代谢途径有很大的影响，通过上调磷脂酶A2的两种同工酶PLA2G3和PLA2G1B的表达，促进溶血磷脂酸(LPA)的生物合成，从而促进hDPSCs成骨分化。Wang等[43]研究表明柚皮苷明显促进hBMSCs 的增殖，还以剂量依赖性方式增强hBMSCs 的成骨分化并上调成骨标志物RUNX-2、OXS、OCN 和COL1 的蛋白和mRNA 表达水平，加入ERK抑制剂U0126后，柚皮苷对细胞成骨分化的促进作用和对ERK信号通路的激活均被逆转，提示柚皮苷通过激活ERK信号通路促进hBMSCs的增殖和成骨。

2.7 芹菜素(apigenin) 芹菜素是一种黄酮类化合物，在天然植物中含量丰富，主要存在于芳香植物(如洋甘菊、薄荷、欧芹)、蜂蜜和小麦中。越来越多的证据表明，芹菜素具有抗炎、抗氧化和抗癌活性，以及明显的雌激素样作用[44]，据报道可预防去卵巢小鼠的骨质流失。Pan等[45]研究发现芹菜素在体外可增强关键转录因子β-catenin 及其下游几个Wnt 信号的靶基因的表达，从而激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进人间充质干细胞(hMSCs)的成骨分化，使用大鼠股骨骨折模型，发现芹菜素在体内表现出促进新骨形成和加速骨折愈合的作用。Zhang 等[46]则提出，芹菜素可显著提高hMSCs 中p-JNK、p-p38 的表达水平，加入JNK抑制剂(SP600125)或p38MAPK 抑制剂(SB203580)可阻断芹菜素诱导的ALP 活性、OPN、Runx2 和OSX 的表达，提示芹菜素或许是通过激活JNK 和p38MAPK信号通路，促进hMSCs 的成骨，诱导骨结节的形成。汪芹芹等[47]证明一定浓度(5 μmol/L)下的芹菜素可以刺激hDPSCs增殖，诱导其成骨向分化，提高成骨标志基因OCN 与RUNX2 的表达，且在hDPSCs 联合植骨材料修复兔颅骨缺损中，芹菜素有明显的促进成骨作用，或许将来可以为临床骨缺损提供新的修复方案。

2.8 黄芩苷(Baicalin) 黄芩苷是中药黄芩中的主要有效成分，是一种天然生物活性黄酮类化合物，具有很强的抗炎、抗氧化等多种生物活性。作为一种植物雌激素，黄芩苷可以模拟雌激素作用，抑制人乳腺癌雌激素受体阴性细胞株MDA-MB-231细胞的增殖，诱导细胞凋亡[48]。Kimura等[49]发现用黄芩苷处理人成牙骨质细胞(HCEM)，上调ALP 和Runx2 的mRNA表达，促进ALP和Runx2的蛋白水平、ALP活性和钙沉积，加入Wnt 信号通路阻断剂DKK-1 可抑制这些成骨刺激作用，提示黄芩苷可通过Wnt/β-catenin信号通路促进HCEM 向成骨细胞分化，可能有助于牙周组织再生工程。马永刚等[50]研究发现，高浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)的成骨分化表现出明显抑制作用，而低浓度黄芩苷对SCAPs成骨分化及细胞生长有促进作用，20 μmol/L黄芩苷可显著增强DPSCs 的RUNX2、DSP、OSX、OPN、OCN等成骨标志基因的mRNA和蛋白表达，甚至能缓解或纠正由炎症引起的DPSCs分化能力下降问题。

3 展望

颌面部骨缺损是临床常见疾病，为了恢复患者缺损部位的结构和功能，使用骨组织工程手段修复颌骨缺损或许是更好的选择。骨组织工程除了构建支架外，还需要寻找合适的种子细胞和成骨诱导因子，DPSCs在骨再生方面具有许多优势，包括较高的增殖率、良好的成骨分化潜能以及较低的免疫原性等，此外还具有来源丰富、取材方便、可长久冷冻保存等优点。植物雌激素能作为一种有效的诱导剂应用于DPSCs的培养及诱导成骨，有些植物雌激素直接作用于DPSCs 上的雌激素受体发挥作用，或是通过各种信号通路如ER、MAPKs、Wnt/β-catenin、NF-κB 信号通路和BMP-2 途径等，调节靶基因的表达，诱导产生各种细胞因子间接影响DPSCs增殖与成骨分化，或许可以为骨组织工程修复颌骨缺损提供新的思路。

然而就目前的研究状况而言，植物雌激素在调控DPSCs成骨分化方面还存在一定的局限，除了淫羊藿苷、柚皮苷、大豆苷元等几种知名类雌激素研究得较为深入外，其他植物雌激素的研究内容相对不足，植物雌激素的浓度等级、DPSCs上雌激素受体基因的编码转录与表达调控、如何构建细胞支架等尚存在一定的争议，需进一步研究。