崔童(综述), 楼晓慧, 陈亚萍, 南丽红(审校)

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是一个不可逆的疾病进展过程,最终会发展为肾衰竭,进入终末期肾病。目前,CKD患者数量逐年增多,全球CKD患者达8%～16%,故CKD已成为全球公共健康问题,严重威胁人类健康[1]。肾间质纤维化(rental interstitial fibrosis, RIF)是各种肾脏疾病发展过程中关键的病理基础,而肾小管上皮细胞(renal tubular epithelical cells, RTECs)间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是发生RIF的核心环节[2]。因此,合理干预EMT可有效降低RIF发生。

1 EMT的概述

EMT是指在一定条件下,上皮细胞失去原有的表型,获得间充质细胞的形态和特征的过程,在组织纤维化的发生、发展中发挥重要作用[3]。EMT的发生涉及多个信号通路,由一系列的细胞因子和生长因子共同参与,使上皮细胞获得间充质细胞的特性,转分化为成纤维细胞(fibroblast, FB),并通过增殖和活化成为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB),合成分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),促进纤维化的形成[4]。1995年,STRUTZ等[5]在受损的RTECs中检测到异常表达的FB特异性蛋白1,首次提出了肾小管EMT。谱系追踪实验证明36%的MFB来源于RTECs,认为RTECs EMT 是产生MFB的主要机制[6]。另有研究[7-8]发现,在 EMT 过程中,RTECs 可不完全通过转分化为MFB促进纤维化,还可通过损伤RTECs的吸收和分泌功能,诱导细胞周期停滞在 G2/M 期,分泌促纤维化因子,进而影响 RIF 的进程。因此,通过调控 EMT 的发生、发展,可成为延缓 RIF 的有效靶点。

2 EMT 的过程

EMT 是 RIF 的早期发病机制,其发生的主要过程包括上皮细胞失去黏附特性、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达和重组、肾小管基底膜的破坏、细胞迁移和侵袭能力增强[9],其主要特征可概括为:(1)细胞的极性消失。上皮细胞具有端-基极性,可固定于基底膜上。当上皮细胞转化为FB时,细胞的极性就会消失。(2)细胞间紧密消失。正常情况下,RTECs通过细胞间黏附分子与其他细胞紧密连接。在致病因素的作用下,细胞间黏附分子的表达受到抑制,导致细胞间紧密连接消失[10]。(3)E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表达减少。E-cad 参与黏附连接的形成和上皮细胞的连接,建立和维持上皮细胞极性和细胞间结构的完整性。EMT 发生时,伴随细胞极性的消失和细胞间紧密消失,E-cad表达减少[11]。(4)α-SMA 表达增加。在病理状态下,RTECs发生EMT,FB增殖活化,细胞表型发生改变,成为表达 α-SMA 的MFB[12]。(5)细胞迁移和侵袭能力增加。在EMT的过程中,基底膜断裂,MFB可获得更强的迁移和侵袭能力,迁移至肾间质区,分泌并合成ECM,加速 RIF 的发展[13]。

3 中药抗 EMT 的研究

中药防治 RIF 具有丰富的理论依据和治疗经验,已表现出其独特的优势。近几年来,许多中药治疗肾脏病的机制研究开始聚焦于 EMT,中药可以通过调控 EMT 延缓 RIF 的进程,从而发挥肾脏保护作用。多项研究表明,单味中药和中药复方均可拮抗 EMT,效果显著。现总结如下。

3.1 单味中药及其有效成分抗 EMT 的研究 目前,单味中药防治EMT的研究主要集中在单味中药及其有效成分,如黄芪、丹参、三七和大黄等,均具有较好的疗效。

3.1.1 黄芪 研究[14-15]发现,蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)/糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)信号途径在RIF的发病中起重要作用。当PKB磷酸化激活后,可磷酸化下游分子的 GSK-3β,使之失活,从而抑制了 GSK-3β降解β-连环蛋白(β-catenin)的作用,导致胞质内β-catenin 含量增加,更多的β-catenin 移至细胞核,与来自淋巴增强因子 1(lympoid enhancer factor 1, LEF1)/T细胞因子(T cell factor, TCF)家族转录因子结合,从而启动下游靶基因(EMT关键分子)的转录,加剧 EMT 的进程。黄芪是常用的补气药,对肾脏具有保护作用[16]。黄芪中的有效成分黄芪甲苷可通过逆转 PKB/GSK-3β信号途径,抑制 EMT 的发生、发展,发挥保护肾脏的作用[17]。HU等[18]的研究发现,趋化因子 CX3C 的配体1(chemokine CX3C ligand 1, CX3CL1)可使加速纤维肉瘤蛋白(rapidly accelerate fibrosarcoma protein, Raf)磷酸化并激活,激活状态下的Raf进一步通过其位于 C 端的 CR3 结构域作用于下游丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase, MEK)的丝氨酸位点,使其磷酸化并激活,活化的MEK可使细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)的酪氨酸和苏氨酸残基发生磷酸化并活化,活化的ERK进入细胞核,激活EMT相关转录因子,如锌指转录因子(snail family zinc finger 1, Snail 1)家族等,这些转录因子被激活后促进E-cad的降解,从而诱导 EMT 的发生、发展。黄芪甲苷可通过抑制 CX3CL1 的表达,进而抑制Raf/MEK/ERK信号通路的激活,改善高糖诱导的 HK-2 细胞 EMT 的发生、发展。

3.1.2 丹参 丹参是常用活血化瘀的中药,近年来,许多研究[19]表明丹参可用于RIF的防治。丹参中的丹参酮 ⅡA 和丹酚酸 B 均有阻断 EMT、抑制 RIF 的作用。Wnt 是一种分泌型糖蛋白,与跨膜受体 Frzzled 结合,激活胞质内的散乱蛋白(dishevelled, Dsh),抑制β-catenin 降解。β-catenin 作为经典 Wnt 信号通路的关键因子,在 EMT 的发生、发展中起重要作用。研究[20]发现,维生素 D 受体(vitamin D receptor, VDR)可与转录因子 TCF-4 竞争结合β-catenin,抑制 TCF-4 的转录活性,阻断其启动 EMT 下游靶基因的转录,减弱 EMT 的发生。丹参酮 ⅡA 可通过上调高糖诱导的 HK-2 细胞中 VDR 的表达,抑制 Wnt/β-catenin 信号通路,减弱 EMT 发生。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和生物大分子物质,维持细胞内环境稳定的基本生命现象。在肾脏近端小管上皮细胞中,自噬的激活有利于维持上皮细胞的稳态,当自噬受到抑制后将导致变性蛋白质和失能细胞器等清除延迟及异常蓄积,诱发EMT[21]。沉默信息调节因子(solent information regulator, SIRT1)是近来发现的一类依赖 NAD+的第 Ⅲ 类组蛋白去乙酰化酶,其可通过一系列转录因子的去乙酰化来促进或增强自噬机制组成分子的表达,从而提高自噬水平,在细胞自噬中发挥重要作用。HE等[22]通过单侧肾切除术制备大鼠RIF模型,发现丹酚酸 B 可改善肾功能,还可降低 EMT 相关蛋白的表达,激活 SIRT1 介导的自噬。当抑制自噬的激活和给予 SIRT1 抑制剂均可阻断丹酚酸 B 对 EMT 的抑制作用,提示丹酚酸B可通过激活 SIRT1/自噬通路来减弱 EMT,进而改善 RIF。

3.1.3 三七 三七是常用的止血中药,具有抗炎、抗氧化等药理作用。三七亦可通过减弱EMT,进而发挥保护肾脏的作用。目前的研究认为,转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGF-β1) 是转分化最重要的调控因子之一,TGF-β1 与其受体结合可使下游的母亲 DDP 同源物 3 (mothers against decapentaplegichomolog 3, Smad 3)发生丝氨酸磷酸化后激活,在细胞质中与 Smad 3 形成三聚体复合物,移至核内调控纤维化相关靶基因的转录,TGF-β1/Smad 信号通路在介导EMT的过程中扮演了重要角色。潘晶[23]的研究发现,三七皂苷可抑制大鼠RTECs的EMT过程,通过给予 SIRT1 激动剂白藜芦醇和SIRT1抑制剂 EX527,结果表明三七皂苷可通过激活 SIRT1,使 Smad 3 去乙酰化,抑制 Smad 3 的转录活性,进而抑制 TGF-β1/Smad 通路,减轻 EMT 的发生。HUANG等[24]的研究发现,新型的三七多糖 SQD4S2 可明显下调 HK-2 细胞中α-SMA、纤连蛋白1(fibronectin 1, FN1)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ alpha 1, Col1A1)和Ⅲ型胶原蛋白(collagen type Ⅲ alpha 1, Col3A1)等关键纤维化相关分子的表达,促进细胞正常功能的恢复,从而抑制 EMT 的发生,发挥抗 RIF 的作用。

3.1.4 大黄 大黄素是大黄的主要活性成分,具有抗 RIF 的作用。SONG等[25]的研究发现,TGF-β1可以抑制人肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(carnitine palmitoytransferase 1A, Cpt1a)的活性,导致ATP消耗和脂质沉积,对RTECs EMT过程至关重要。大黄素可增加 TGF-β1 诱导的RTECs中 SIRT1 的表达,调控信号转导和转录激活因子 3 (Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的去乙酰化,降低其磷酸化水平,抑制转录活性,致 STAT3 不能与 Twist 相关蛋白1(Twist related protein 1, Twist 1)基因启动子近端的结合位点相结合,从而抑制Twist 1的转录活性,减弱 Twist 1对 Cpt1a 的负调节作用,上调 Cpt1a 的表达,以促进 Cpt1a 介导的脂肪酸氧化,进而抑制 EMT 过程。骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)是重要的抗RIF因子,可维持RTECs的表型,直接影响RTECs的成纤维能力,作为TGF-β1超家族的一员,BMP-7 可通过影响 Smads 蛋白在细胞内信号的传递而抑制 TGF-β1 促进 Bim 蛋白表达的作用,从而抑制该蛋白与自噬诱导关键因子的结合[26-28]。LIU等[29]通过单侧肾切除术建立阿霉素诱导的 RIF 大鼠模型和 TGF-β1 刺激的 HK-2 细胞模型,结果表明,大黄素干预后可明显上调 BMP-7 的表达,从而上调自噬关键因子微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)、酵母自噬相关基因6同源物(becn1 gene, Beclin1)的表达,激活细胞自噬,抑制 EMT 的发生,延缓 RIF,起到保护肾脏的作用。

3.1.5 其他 体内外实验研究[30]表明,姜黄素可改善 UUO 小鼠的肾脏病理损伤,抑制 HK-2细胞 EMT 的发生和炎症反应,其可通过抑制 Toll 样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/PKB 信号通路,抑制EMT和炎症反应,改善RIF。XIAO等[31]的研究发现,氧化苦参碱可抑制db/db糖尿病小鼠肾组织 EMT 的发生,亦可逆转高糖诱导大鼠RTECs的 EMT 过程,并减少 ECM 的分泌,其具体机制为分化抑制因子2 (inhibitor of differentiation 2, Id2) 与 Twist 形成二聚体,抑制Twist 对下游因子 E-cad 的转录调控作用,延缓 EMT 的进程。氧化苦参碱可阻断高糖对 Id2 的抑制作用,通过 Id2/Twist 途径拮抗EMT,减少RTECs损伤。研究[32]发现,lncRNA 可结合 miRNA,影响 miRNA 的表达,间接调控 mRNA 的表达。CAI等[33]的研究发现,黄连可通过抑制 lncRNA CLYBL-AS2 的表达,阻断其与 miR 204-5p的结合,使 miR 204-5p 的表达上调,抑制 Snai1 的表达,改善高糖诱导的 HK-2 细胞的 EMT 进展。

3.2 中药复方的抗 EMT 研究 中药复方在防治 EMT 的研究较多,主要包括肾复康、六味地黄汤、四妙散、益肾化瘀方、扶正化瘀方和当归芍药散等。

3.2.1 肾复康 肾复康可抗RIF,具有延缓肾功能恶化的作用[34]。整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)与整合素胞质结构域相互作用,将细胞内骨架蛋白与ECM连接并传递重要生物信号。ILK 作为 TGF-β/Smad 信号通路的重要下游效应因子,可调控E-cad和ECM(Col-Ⅰ、FN)的释放,是 EMT 过程中的重要调节因子。黄上等[35]发现,肾复康含药血清能减弱 Smad 2/3 的活性,抑制 p-Smad 2/3 入核,使 ILK 表达减少,从而抑制 EMT 关键分子的表达,改善细胞形态,减少ECM的沉积,缓解 HK-2 细胞的 EMT 进程,有助于减轻 RIF。

3.2.2 六味地黄汤 六味地黄汤具有滋阴补肾的功效,是常用的经典名方,广泛应用于肾脏疾病的治疗。在低氧的情况下,缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)可激活下游因子 Twist,使 Twist 与 E-cad 启动子结合并募集共抑制因子来抑制 E-cad 的转录,参与 EMT 的调控。董翔[36]通过5/6肾切除法构建 RIF 模型,发现六味地黄汤可有效防治慢性肾脏疾病,其作用与改善肾内缺氧、下调 HIF-1α 和 Twist 的表达、上调 E-cad 的表达、延缓 EMT和减轻 RIF 有关。

3.2.3 四妙散 康洁等[37]采用尿酸诱导HK-2转分化,四妙散干预后可下调结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表达、上调 BMP-7 的表达来维持RTECs表型,逆转EMT,发挥保护肾脏作用。

3.2.4 益肾化瘀方 临床实践证明,益肾化瘀方在治疗肾病方面具有较好的疗效。实验研究[38]发现,益肾化瘀方可改善EMT后的细胞形态,上调 BMP-7 的表达,进而拮抗 TGF-β1 的致纤维化效应,逆转 EMT,缓解 RIF 的进程。γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)是重要的抗RIF因子,其与细胞表面特异性受体结合后,激活 Janus 激酶(Januskinase 1),致 STAT1 发生磷酸化并形成同源二聚体 GAF,进入细胞核内,与 IFN-γ 活化序列反应元件结合,启动 Smad 7 的转录和表达。Smad 7 通过招募 E3 泛素连接酶到 TGF-β1受体,致其泛素化降解,抑制受体对 Smad 2/3 的磷酸化,从而阻断 TGF-β1 的信号通路,逆转 EMT 的发生[39]。李立等[40]通过对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)刺激 HK-2 细胞 EMT 模型证实,益肾化瘀方可通过上调 IFN-γ 的表达,下调 TGF-β1 的表达,进一步抑制 Col-Ⅰ、Col-Ⅳ 的生成,延缓 EMT 的发生。

3.2.5 其他 UUO 大鼠肾组织中 TGF-β1 表达增加,可诱导其下游因子 ILK 的过表达,致 PKB 和 GSK-3β发生磷酸化,GSK-3β的磷酸化使β-catenin 核易位并活化转录因子激活蛋白1(activator protein-1, AP-1),活化的 AP-1 与基质金属蛋白酶-9 的启动子结合,上调基质金属蛋白酶-9的表达,从而降解基底膜的主要支架 Col-Ⅳ,使肾小管基底膜破坏,增强了细胞迁移侵袭,为EMT的细胞最终移行到肾间质起重要作用。扶正化瘀方干预后可明显下调 p-GSK-3β、p-PKB和β-catenin 的表达,减弱 AP-1 的转录活性,以延缓 EMT[41]。激活 Notch 信号通路可通过转录调控 EMT 相关信号分子来激活 EMT,在诱导和调节 EMT 中起着关键作用。研究[42]发现,当归芍药散含药血清可明显降低高糖诱导的 HK-2 细胞中 Notch 信号通路相关分子 Notch 胞内区域(Notch intrecellular domain, NICD)、发状分裂相关增强子5(hairy and enhancer of split 5, Hes5)、Notch 受体(Notch1)和 Notch 配体(Jagged-1)的表达,进而下调α-SMA 的表达,上调 E-cad 的表达,以抑制 EMT,保护受损细胞。WANG等[43]的体内外研究表明,扶正化瘀方能减轻 HgCl2诱导的 RIF 大鼠的病理损伤,其具体机制通过降低 miR-21 的表达,减弱其抑制靶基因磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)的转录作用,使 PTEN 的表达上调,发挥其脂质磷酸酶的活性,抑制 PKB 向质膜转移,进而抑制 PKB 的磷酸化,从而抑制 EMT 和减少 ECM 的沉积,延缓 RIF 的发展。

4 小 结

EMT 的发生是 RIF 发展过程的核心环节。因此合理调节 EMT 是保护肾功能的有效策略。在治疗肾脏疾病的机制研究中,中药可调控 EMT 延缓 RIF,且表现出其独有的优势和特色。EMT 的发生、发展受到多因素、多种机制的调控,是一个复杂的过程。本研究阐述了部分中药和中药复方抑制 EMT 的研究,但中药可以通过在多个环节、多个靶点发挥抗 RIF 的作用。目前,中药抑制 EMT 的研究,主要还是聚焦于动物试验和细胞实验,今后可在中医药理论的指导下,借助现代医学研究成果,将中药抑制 EMT 的机制和作用环节进行深入的研究,有助于开发具有抗 EMT 作用的新型药物及新的治疗途径。