熊海涛，徐艺凤，徐承娥

（1 陕西理工大学 陕西省催化基础与应用重点实验室 陕西汉中 723001 2 陕西理工大学化学与环境科学学院 陕西汉中 723001）

作为一种生物功能组分，焦磷酸盐（Pyrophosphate，PPi）是三磷酸腺苷（ATP）及其它核苷酸的水解产物，在DNA 和RNA 的聚合反应与复制、部分酶促反应、能量传递、多种代谢等生命活动中扮演着重要角色，也可以作为临床诊断与治疗关节炎的一种潜在生物标志物[1-3]。PPi 是一种食品添加剂，可以提高蛋白质成膜的几率，改善肉制品的品质和口味，增加肉制品的渗透能力，在一定程度上抑制肉制品褪色和变质，并能增加肉制品的弹性[4]。而如果摄入过量的PPi 可使钙磷聚合物大量产生，进而导致血管发生钙化[5]，甚至致癌[6]。建立一种准确且灵敏的PPi 检测方法，对保证食品安全及临床诊断十分重要。

目前，检测PPi 的方法主要有比色法[7-9]、色谱分析法[10-11]、荧光光度法[12-15]、生物发光法[16]、化学发光法[17-18]及电化学分析法[19-21]等。其中，荧光光度分析法具有操作简单，灵敏度与准确度较高等优点，受到较多关注。近些年，利用荧光光度法测定实际样品中PPi 含量的方法主要有两种[22]：1）设计并合成有机荧光探针，以选择性识别与检测PPi[23-24]；2）利用金属离子与合成的荧光探针及PPi 之间的竞争反应，以实现对少量PPi 的高灵敏检测[25]。然而，荧光探针大多需要特殊设计，而且合成过程较为复杂，分离繁琐、费时，成本较高，因此其应用受到一定的限制。

本研究采用具有微弱荧光的茚三酮-过氧化氢混合体系为基底反应物，通过在基底液中加入具有催化活性的Cu2+，使体系的荧光强度增强。当体系中加入少量的PPi 后，基于Cu2+能与PPi 形成稳定的配离子，使催化体系的荧光强度降低，从而建立一种新型荧光光度法，以检测食品中焦磷酸盐含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾仁与带鱼样品均购自汉中市水产品市场。

冰乙酸（99.5%），天津市登峰化学试剂厂；无水乙酸钠，天津市化学试剂六厂；过氧化氢（30%），成都市科龙化学品有限公司；焦磷酸钠，天津市同鑫化工厂；茚三酮，天津市大貌学试剂厂；硫酸铜，天津市天力化工有限公司。试验用水如无特别说明，均为超纯水，固体试剂均为分析纯级。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH 5.5）；硫酸铜溶液（1.0×10-3mol/L）；H2O2（1.0 mol/L）；茚三酮溶液（1.0×10-2mol/L）。焦磷酸钠储备液（1.0×10-2mol/L）：在电子天平上准确称量0.2660 g 焦磷酸钠固体，用超纯水溶解，并定容于100 mL 容量瓶中，摇匀。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅（KQ-700VDE 型），北京科伟水兴仪器有限公司；粉碎机（FW-80 型），郑州科丰仪器设备有限公司；电子天平（AR124CN 型），奥豪斯仪器（上海）有限公司；荧光分光光度计（F-4600 型），日立高新技术公司；烘箱（MH-1000型），北京科伟永兴仪器有限公司；马弗炉（KRD-16CMA 型），山东科瑞达电炉有限公司。

1.3 样品预处理

首先，将适量虾仁与带鱼用水洗净，虾仁置于60 ℃烘箱中烘干，切碎并研磨成粉末，备用。将带鱼低温冷冻24 h，取可食用部分，剪成小块状用粉碎机彻底搅碎，充分搅拌混匀，备用。取上述两种样品各2.5000 g，分别置于2 个瓷坩埚中，通过电炉加热使其碳化，再将二者于马弗炉（600 ℃）内灰化6 h。冷却至室温，将其分别转移至2 只烧杯中，并加入少量NaOH 与超纯水使其全部溶解，加入活性炭并搅拌8 min，静置30 min。最后，依次使用滤纸、0.45 μm 及0.22 μm 滤膜各过滤1 次，将获得的透明样品溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释至10 mL。以同样的方法，虾仁与带鱼各平行处理2 份。

1.4 试验方法

取两支25 mL 的比色管依次编号1、2，各加入5.0 mL 茚三酮（1.0×10-2mol/L）溶液，1 号比色管中加入0.5 mL 过氧化氢及0.5 mL 的硫酸铜溶液储备液，然后用pH 为5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至刻度线，2 号比色管加入0.5 mL 过氧化氢，0.5 mL 的硫酸铜溶液储备液及一定浓度的焦磷酸钠溶液，然后用相同的缓冲溶液定容至刻度线，每支比色管摇匀，再静置30 min 后，用F-4600 荧光光度计以310 nm 为激发波长测定茚三酮-H2O2-Cu2＋（F1）、茚三酮-H2O2-Cu2＋-PPi（F2）两个不同反应体系的荧光发射光谱。然后，在421 nm 的发射波长处，以降低的荧光强度（ΔF=F1-F2）对标准系列PPi 浓度的对数值作图，以对食品样品中的焦磷酸盐含量进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 不同体系荧光光谱的研究

按照1.4 节的试验方法，分别测定茚三酮-缓冲液、茚三酮-H2O2-缓冲液、茚三酮-H2O2-Cu2＋-缓冲液、茚三酮-H2O2-Cu2＋-PPi-缓冲液4 个反应体系的荧光发射光谱（固定其激发波长均为310 nm）。如图1 所示，4 种体系的荧光发射波长均为421 nm，茚三酮-缓冲溶液体系（曲线a）无明显的荧光产生，茚三酮-H2O2-缓冲溶液体系（曲线b）荧光强度为1 685，这可能是由于茚三酮与H2O2之间的氧化产物具有微弱的荧光特性；而茚三酮-H2O2-Cu2＋-缓冲溶液体系（曲线c）的荧光强度为8 077，说明Cu2＋在酸性介质下能显著催化茚三酮-H2O2之间的氧化还原反应而获得较高的荧光强度，这与文献[26]报道相一致。而当茚三酮-H2O2-Cu2＋-缓冲溶液加入少量的PPi 后（曲线d），体系的荧光强度变为4 415，这可能是由于加入的PPi 与反应体系中的Cu2＋稳定结合，而生成焦磷酸合铜（II）配离子，使茚三酮-H2O2-Cu2＋体系的荧光强度显著减弱。结合已报道的文献[26]～[28]，推测PPi 的检测原理如图2 所示，当体系中没有PPi 存在时，Cu2+能催化过氧化氢氧化茚三酮而产生大量的氧化产物，该氧化产物在310 nm 的激发波长下，具有非常强的荧光发射波长（λEM=421 nm）。而当在Cu2+-过氧化氢-茚三酮体系中加入少量PPi后，基于PPi 能与Cu2+形成稳定的[Cu（PPi）2]6-而使体系中游离态的Cu2+数目大量减少，从而减弱了体系中的催化-氧化反应程度，致使茚三酮的氧化产物量减少，此时仅能在421 nm 的发射波长（λEX=310 nm）处检测到1 个较弱的荧光发射。根据PPi 存在前、后，Cu2+-过氧化氢-茚三酮体系荧光发射的显著差异，可研发一种新的阻抑荧光光度法对实际样品的PPi 进行准确检测。

图1 不同体系荧光发射光谱图Fig.1 Fluorescence emission spectrums of different systems

图2 检测PPi 的原理说明图Fig.2 Schematic illustration of the mechanism for the determination of PPi

2.2 试验条件优化

2.2.1 过氧化氢浓度的选择 考察过氧化氢浓度（4.0×10-6，6.0×10-6，8.0×10-6，1.0×10-5，2.0×10-5，3.0×10-5，4.0×10-5，5.0×10-5mol/L）对选定体系荧光强度的影响。由图3 可知，随着过氧化氢浓度的增加，相对荧光强度先增强后减弱；当过氧化氢浓度为3.0×10-5mol/L 时，体系的荧光降低幅度最大；当过氧化氢的浓度小于3.0×10-5mol/L 时，随着过氧化氢浓度的增加，体系的相对荧光强度逐渐增大。可能是由于较低浓度的过氧化氢导致体系间的氧化还原反应较弱，随着过氧化氢浓度的增加，体系的相对荧光强度增强。而当过氧化氢的浓度大于3.0×10-5mol/L 时，体系的相对荧光强度有所减弱，这可能是由于随着过氧化氢浓度的持续增大，体系的荧光空白信号与标准溶液荧光信号均增加，而少量的Cu2+与PPi 对体系的荧光特性影响较小。因此，确定过氧化氢的最佳浓度为3.0×10-5mol/L。

图3 不同过氧化氢浓度对体系荧光强度的影响Fig.3 Effect of different concentrations of hydrogen peroxide on the relative fluorescence intensity

2.2.2 最佳时间的选择 设置茚三酮-H2O2-Cu2+及茚三酮-H2O2-Cu2+-PPi 两种体系溶液均反应5，10，15，20，30，40，50 min 后进行荧光光谱扫描。由图4 可知，在两种体系各自反应40 min 时，相对荧光强度达到最大值，再延长反应时间，荧光信号减小的程度基本保持不变。这说明PPi 与Cu2+在40 min 时反应完全。因此，确定最佳反应时间为40 min。

图4 不同反应时间对体系相对荧光强度的影响Fig.4 Effect of reaction time on the relative fluorescence intensity

2.2.3 茚三酮浓度的选择 加入不同浓度（2.0×10-4，4.0×10-4，6.0×10-4，8.0×10-4，1.0×10-3，2×10-3，3×10-3，4.0×10-3mol/L）的茚三酮，其它反应条件不变，对茚三酮-H2O2-Cu2+及茚三酮-H2O2-Cu2+-PPi两种体系荧光光谱扫描。由图5 可知，随着茚三酮浓度的增加，相对荧光强度先增强后减弱，这可能是由于过低浓度的茚三酮会得到较弱的荧光发射峰值，而过高浓度的茚三酮会使少量焦磷酸根存在，恢复的体系荧光发射不明显，而当茚三酮浓度为2.0×10-3mol/L 时荧光强度减弱程度最大。因此，确定茚三酮的最佳浓度为2.0×10-3mol/L。

图5 不同茚三酮浓度对荧光减弱程度的影响Fig.5 Effect of different concentrations of ninhydrin on the decreasing fluorescence intensity

2.2.4 Cu2+浓度的选择 在其它反应条件不变的情况下，考察不同Cu2+浓度（1.0×10-5，2.0×10-5，4.0×10-5，6.0×10-5，8.0×10-5mol/L）对茚三酮-H2O2-Cu2+及茚三酮-H2O2-Cu2+-PPi 两种反应体系荧光强度的影响。如图6 所示，随着Cu2+浓度的增大，体系的相对荧光强度呈先增大后减小的趋势；当Cu2+浓度为6.0×10-5mol/L 时，体系的荧光强度下降最大；当Cu2+浓度超过6.0×10-5mol/L 时，体系的荧光强度变化有所减弱。这可能是由于Cu2+浓度过高会导致体系的空白荧光信号较强，而少量的PPi 加入反应体系后，形成稳定的[Cu（P2O7）2]4-较少而不足以影响的催化体系的荧光强度。故确定Cu2+浓度为6.0×10-5mol/L。

图6 Cu2+浓度对体系相对荧光信号的影响Fig.6 Effect of Cu2+ concentration on the relative fluorescence signal

2.2.5 反应温度的选择 在固定上述条件的情况下，考察不同温度（10，20，30，40，50，60 ℃）对反应体系荧光强度的影响。由图7 可知，随着温度的升高，荧光的降低强度呈先增加后减弱的趋势，在10～30 ℃时，随着温度的升高，反应体系的荧光强度降低程度增强，这可能是由于反应温度升高促进了该反应体系的反应效率；在30～60 ℃时，随着温度的升高，体系的相对荧光强度呈下降趋势，这可能是由于反应温度过高会使Cu2＋与PPi 之间的配位效应减弱。因此，确定30 ℃时对体系进行荧光光谱扫描。

图7 反应温度对体系相对荧光强度的影响Fig.7 Effect of reaction temperature on the relatire fluorescence intensity

2.3 优化方法的分析特性

在上述优化的试验条件下，降低的荧光强度（见图8a）与PPi 的浓度在3.0×10-7～8.0×10-6mol/L范围内的对数值呈良好的线性相关（见图8b），其回归方程为ΔF=722.2lgC ＋4868，相关系数为0.9915，方法的检出限为3.2×10-8mol/L。对含有4.0×10-7mol/L PPi 的反应体系进行平行11 次测定，其相对标准偏差为4.9%，说明该方法具有良好的重现性。

图8 不同PPi 浓度的荧光发射光谱（a）与校准曲线（b）Fig.8 Fluorescence emission spectrums（a）in the presence of different concentrations of PPi and calibration curve（b）

2.4 干扰组分的考察

在最优的试验验条件下（过氧化氢浓度为3.0×10-5mol/L，茚三酮浓度为2.0×10-3mol/L，Cu2＋浓度为6.0×10-5mol/L，反应时间为40 min，反应温度为30 ℃），固定加入PPi 的浓度为1.0×10-6mol/L，保证相对误差的绝对值不超过5%，考察共存组分对本方法测定焦磷酸根离子的干扰情况。结果表明，200 倍的F-、Cl-、Br-、NO3-，100 倍的淀粉、SO42-，50 倍的三聚磷酸盐、多聚磷酸盐，10 倍的半胱氨酸、PO3-、PO43-、Mg2＋、Zn2＋均对PPi 的检测均无干扰。

2.5 样品测定及回收率验证

在最优的试验条件下（过氧化氢浓度为3.0×10-5mol/L，茚三酮浓度为2.0×10-3mol/L，Cu2＋浓度为6.0×10-5mol/L，反应时间为40 min，反应温度为30 ℃），准确移取1.3 节处理的两种样品各1.0 mL，按照1.4 节的试验方法测定虾仁与带鱼样品处理液中焦磷酸盐的含量，并分别加入适量的PPi标准液进行加标回收试验，测定结果见表1。虾仁与带鱼样品中焦磷酸盐的含量分别为6.23×10-3，7.15×10-3g/kg，均低于欧美国家要求的最高限量（＜0.5 g/kg）[10]，加标回收率在93.00%～97.80%之间，其相对标准偏差均小于4.8%。这说明本试验所述方法具有较高的准确度与精密度。

表1 样品分析与回收率测定结果（n=3）Table 1 Sample analysis and recovery results（n=3）

3 结论

本文利用Cu2＋与PPi 的配位作用强于Cu2＋与茚三酮之间的相互作用，在一定程度上减弱了Cu2＋对茚三酮-H2O2体系氧化还原反应的催化作用，使选择体系的荧光强度明显减弱。设计了一种荧光光度法检测焦磷酸盐含量的新方法，采用此方法检测虾仁与带鱼样品中焦磷酸盐含量，二者的平均回收率分别为95.71%和95.40%。该测定方法试剂廉价，灵敏度与准确度较高，有望为食品样品中焦磷酸盐的含量分析提供一定的数据参考。