陈芬兰 程计林 林文 陈丽萍

作者单位：350300 福建医科大学附属福清市医院感染科(陈芬兰,林文);复旦大学附属公共卫生临床中心消化科(程计林,陈丽萍);上海交通大学医学院附属仁济医院消化科(陈丽萍)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的慢性感染可导致慢性肝炎、肝硬化,甚至肝癌的发生。共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)在肝脏细胞内的持续存在是HBV难以清除进而持续性感染的主要原因。另外,作为最关键的细胞内复制中间体,HBV cccDNA的存在和转录活性也是评价抗病毒治疗效果最直接有效的指标。但是,检测cccDNA需要通过肝穿刺活组织检查,在临床实践中不便广泛开展,进一步探究可以代替的血清学指标尤为关键。前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)作为cccDNA的直接转录产物,可以反映cccDNA转录活性,同时它作为病毒逆转录的模板,是目前唯一一种可以在外周血中检测出来的HBV RNA。众多研究表明[1-3],即使在HBV DNA低于检测下限、甚至乙肝表面抗原(HBsAg)转阴后的HBV感染者血清中HBV RNA仍存在。因此,相较于HBV DNA等指标,HBV RNA在评估抗乙肝病毒疗效、选择停药时机及预测停药后复发风险等方面均具有较高的临床价值。近年来,不同于以血清HBsAg丢失为特征的“功能性治疗”[4],基于血清HBV RNA的持续丢失与cccDNA的消除或转录沉默相关的“超功能治疗”得到越来越多的关注[5]。现就目前HBV RNA与临床指标相关性、评估抗病毒疗效、指导临床用药等相关研究进展作一综述。

一、HBV的复制机制及血清HBV RNA的来源

HBV侵入正常肝脏细胞后脱去核衣壳成为松弛环状双链DNA(relaxed circular DNA,rcDNA),rcDNA进入肝细胞核后,在DNA聚合酶作用下填补缺口,进行扭转、折叠等过程,成为具有超螺旋结构的HBV cccDNA;接着以HBV cccDNA为模板,分别转录出0.7、2.1、2.4、3.5kb四种不同长度的mRNA,再合成多种病毒蛋白。其中3.5kb的RNA有两种表达模式[6],一种为可编码乙肝e抗原(HBeAg)相关蛋白的pre-CmRNA,另一种即为逆转录模板的pgRNA。pgRNA主要有两个去处:一部分可利用逆转录酶再逆转录合成rcDNA中的负链,后者在DNA聚合酶(P蛋白,也是由pgRNA翻译而成)引导下合成正链DNA,然后正、负链DNA重新组合成为新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA可以再次进入肝细胞核转化成为新的HBV cccDNA,还可以与病毒蛋白重新组装后释放到肝细胞外,成为有完整病毒颗粒的HBV DNA,再感染新的正常肝细胞。另一部分pgRNA经过衣壳组装和病毒包膜蛋白包被释放入血,研究已证实有包膜的血清HBV RNA主要由pgRNA组成[1, 2, 7],表达于HBV相关性肝病患者的血清中,故常规提及的血清HBV RNA实际上指的就是血清中的pgRNA,作为直接转录产物及逆转录的模板的新型血清学标志物,pgRNA特殊性被日益重视。

二、与临床指标的相关性

Wang等[1]认为血清HBV pgRNA与转氨酶、血清HBV DNA、HBsAg、乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)有一定相关性,但其相关性受HBeAg状态和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的影响;Gu等[8]发现,与ALT正常患者(≤40 IU/mL)相比,ALT升高(>40 IU/mL)患者血清HBV pgRNA水平明显升高。

Butler等[9]发现在对慢乙肝患者进行核苷(酸)类似物(NA(s))治疗期间,血清中HBV DNA与pgRNA水平关联性低,血清pgRNA浓度普遍高于HBV DNA浓度;而没有应用NA(s)治疗时,HBV DNA与pgRNA水平相关性高,血清pgRNA浓度大约比HBV DNA低2logIU/mL。

Chan等[10]的研究发现,HBsAg<100 IU/mL的患者血清HBV pgRNA检出率低,Huang等[11]认为在HBeAg(+)患者中,血清HBV pgRNA与HBsAg呈正相关,而在HBeAg(-)患者中血清HBV pgRNA与HBsAg无相关性。然而,另一项来自北美的队列研究[12]发现未治疗的慢乙肝患者中,无论是HBeAg(+)或是HBeAg(-),HBV RNA 与HBcrAg、HBV DNA呈中度相关联,并且在HBeAg(-)患者中,HBV RNA、HBcrAg与ALT、肝纤维化指标水平呈高度正相关。

有研究发现[13],经过 3 年的抗病毒治疗后,即使血清 HBV DNA 保持阴性,但分别有近1/3的患者血清可检测到HBcrAg和 HBV RNA,甚至在HBV DNA、HBsAg均为阴性时,患者血清HBV pgRNA均存在阳性[5]。Wang等[1]的研究还发现,血清HBcrAg水平是HBV pgRNA低于检测下限的独立预测因子,最佳截断值为6.6log10U/mL。Wang等[14]的研究发现,基线时肝内cccDNA和血清中RNA水平呈正相关,但是NA(s)治疗48周发生HBeAg转换后,血清中RNA与cccDNA水平再无相关性,这可能与NA(s)的作用机制相关,抗病毒后干扰了HBV正常生命周期所导致。

三、评估抗病毒药物疗效及血清学转换

抗HBV治疗过程中,常规说来血清HBV DNA水平的下降代表了病毒被有效抑制,DNA水平很快下降至低于检测下限即实现了病毒学应答,但DNA水平无法准确反应HBV cccDNA状态。有观点认为,NA(s)治疗可降低HBV DNA,但是HBV RNA却升高[15];然而,也有观点认为,NA(s)也可以降低血清HBV RNA[16],只不过RNA下降较DNA慢[14]。所以对于评估抗病毒药物疗效,结合血清HBV RNA的测定具有更好的指导作用[17]。慢乙肝患者经长期NA(s)抗病毒治疗后的血清学抗原状态可能与血清HBV pgRNA的存在及表达量有关,HBV pgRNA的持续存在可能是导致HBsAg持续高水平及HBeAg血清转换率低的原因。Chan等[10]发现HBsAg<100 IU/mL且HBeAg发生血清学转换的患者,其血清HBV pgRNA检出率很低,表明这类患者肝内HBV cccDNA转录活性处于抑制状态,因此这部分人群是实现HBV功能性治愈的最佳优势人群。Luo等[18]的研究表明,慢乙肝患者在NA(s)治疗前血清HBV RNA水平低于4.12log10copies/mL时,可实现HBeAg血清转化,且HBV pgRNA的高载量与实现HBeAg清除失败的高风险相关,NA(s)治疗48周后HBV pgRNA仍为阳性的患者,HBeAg转阴失败的概率高,这些患者需要更长的时间实现HBeAg转阴及HBV DNA转阴[18]。Van等[19]研究发现,在抗病毒治疗后出现血清HBeAg阴转的患者中,血清HBV RNA水平在治疗的第12周、24周均下降明显,且相比于HBV DNA、HBsAg等标志物变化,治疗后第12周、24周血清HBV RNA水平的下降对于预测HBeAg的血清学转换具有更好的预测价值。HBeAg阴性和基线较低的HBV pgRNA水平是ETV治疗后早期病毒学应答的独立预测指标[20]。

在评价干扰素治疗效果方面,血清HBV RNA可能更好地反映干扰素抑制病毒复制的情况,同时对免疫学应答有预测作用[21]。Jia等[22]的研究表明,对于初治HBeAg阳性的患者基线时HBV RNA>200000拷贝/mL,干扰素治疗12周后HBV RNA>3000拷贝/mL,在治疗24周时很难实现血清学转换,以此来预测干扰素治疗获益。

另外,HBV RNA可以联合其他指标来评估HBeAg(+)乙肝患者抗病毒疗效。Huang等[23]认为在HBeAg阳性的慢性HBV感染者中,血清HBV DNA联合RNA比单独血清HBV RNA或DNA能更好地反映肝内cccDNA活性,这可能与HBeAg阳性患者的cccDNA转录活性较高、HBV基因型、HBV基础核心启动子突变、HbeAg阴性患者病毒的增殖力受损等有关[20]。总之,检测HBV RNA水平有助于治疗效果的判断,从而优化抗HBV治疗选择。

四、预测停药后病毒反弹风险

慢乙肝患者经治疗达到标准停药后易出现病毒反弹,多因素回归分析发现[6],HBV pgRNA水平、ALT水平、停药时HBsAg水平、HBV DNA水平均为慢性乙型肝炎患者停药复发的危险因素,而HBV pgRNA水平与停药复发风险呈显著非线性关系。Chen等[24]认为,对于高水平HBsAg的慢乙肝患者,即使发生HBeAg血清转换, HBV pgRNA检出率仍然较高,表明其肝内HBV cccDNA的转录活性仍比较活跃,HBV复制仍在进行。这就解释了仅HBeAg血清转换发生而HBsAg水平仍较高的患者,一旦停药后复发率仍比较高的问题。有研究认为[13, 15], NA(s) 能够通过抑制逆转录降低HBV DNA,但是却使得RNA升高,这就导致了治疗停药后的病毒学反弹率和疾病复发率仍居高不下。

Huang等[11]对接受NA(s)治疗的患者血清HBV pgRNA的动态变化进行了研究分析,发现血清HBV pgRNA水平可反映NA(s)的抗病毒效能。由于ETV比LAM能更有效地抑制反转录酶及HBV DNA的合成,所以接受ETV治疗的患者血清HBV pgRNA峰值水平和检出概率都显著高于接受拉米夫定(LAM)治疗的患者。Wang等[15]对33例治疗结束时HBV DNA未检出的慢乙肝患者血清HBV pgRNA进行检测,其中21例CHB患者血清中HBV pgRNA仍呈阳性,且这些患者均在治疗后24周出现病毒反弹,而另外12例HBV pgRNA检测不到的患者中,仅3例患者出现病毒反弹。另一项研究发现,在ETV治疗结束时,HBsAg≥2logIU/mL或HBV pgRNA≥1466拷贝/mL为停药后病毒学复发的独立预测因子[20]。另外,联合指标作为预测因子的研究也日益增多,GUT刊文就RNA联合HBsAg来确定是否可以停用ETV,研究显示[25]血清RNA ≥44.6 U/mL的患者在停药48周后93.25%会出现HBV DNA的反弹,而HBV RNA定量少到接近不可测且HBsAg <10 IU/mL 的患者仅有9.1%出现HBV DNA反弹。这都提示HBV pgRNA的高载量与停止NA(s)治疗后病毒反弹的高风险关联,应该作为指导NA(s)治疗安全停药的指标。

最近的研究结果[26, 27]显示,由于HBV基因可整合到宿主基因组,整合的HBV DNA易发生突变、缺失、插入和重排,丧失转录成HBV pgRNA的能力,且某些整合的HBV基因片段仍可产生HBsAg,因此少数CHB患者在按照停药标准停药时,其血清HBsAg水平不能很好地反映肝细胞内cccDNA的状态。血清HBsAg定量水平对NA(s)的治疗结果预测价值不高,HBV pgRNA必须经过完整的cccDNA转录才能产生,所以理论上讲,血清HBV pgRNA应作为指导临床抗病毒用药的指标,可在NA(s)停药前检测血清中的HBV pgRNA水平,对患者的复发风险进行预判,将有助于甄别出那些已达到病毒学应答并在停药后能维持病毒学应答的“部分治愈”患者,从而实现安全停药。

五、抗HBV药物的选择及新药研发

目前临床常用的NA(s)[15]虽然可以阻断HBV DNA聚合酶参与的逆转录过程,但却能够导致HBV pgRNA水平升高。干扰素除了可以通过抑制HBV pgRNA的转录来抑制HBV复制,还可以介导巨噬细胞分泌外泌体,并携带miRNA-574-5p进入感染HBV的肝细胞[28],从而抑制HBV pgRNA的转录,降低肝细胞HBV cccDNA含量和HBsAg水平,所以近年来联合两者的治疗方案也是不错的选择。

靶向作用于HBV复制周期的抗病毒药物近来得到关注[29, 30],目前直接作用核心组装调节剂(CAMs)的新型抗HBV药物,对HBV复制周期有重要影响,可以干扰HBV复制周期的几个步骤,包括cccDNA的形成、衣壳组装、pgRNA和聚合酶包装。目前,根据分子结构的不同,CAMs有三种类型,分别是杂芳基二氢嘧啶(HAP)、苯丙烯酰胺(PPA)和磺胺酰基苯甲酰胺(SBA)衍生物,相关研究正在开展。除此之外,现在有多种siRNA分子抑制剂可以降低病毒mRNA和pgRNA的表达。然而,将HBV特异性siRNA在体内传递给所有感染的肝细胞仍然是个挑战[31]。

六、展望

既往评估慢乙肝病情指标主要局限于HBV DNA、HBeAg、ALT、HBsAg、肝组织学等的改变,虽然经抗病毒治疗后部分指标可恢复正常,但停药后易出现病毒反弹;HBsAg发生血清学转换后,并不意味着病情完全缓解, 患者肝内仍残留cccDNA,进一步导致肝细胞发生病变。因此,血清HBV RNA水平可作为HBV cccDNA水平的替代检测,综合评估抗病毒疗效和预测治疗终点,并为临床抗HBV治疗、选择合适的停药时机及分析预后提供有意义的个体化指导。另外,针对包括HBV pgRNA在内的HBV复制机制的新药设计,即研发针对HBcAg生成和核衣壳装配的抗病毒药物可能会为未来HBV的治愈带来曙光。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。