李蕊,张志强,高扬

(北京康仁堂药业有限公司 中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心北京市中药配方颗粒工程技术研究中心,北京 101301)

荆芥穗之名始载于《食疗本草》,是经典中药,自唐代沿用至今,《神农本草经》将之列为草部中品。荆芥穗为唇形科植物荆芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗。夏、秋二季花开到顶,穗绿时采摘,除去杂质,晒干[1]。荆芥穗,味辛,性微温,归肝肺经,是一味常用的中药解表药[1],用药历史悠久,民间用于治疗头风、虚劳、妇人血风等[2]。现代药理学研究证明,荆芥穗具有抗炎、抗病毒和镇痛作用,并具有一定的抗补体作用[2]。荆芥穗治疗妇科血症、带下等疾病,也取得较好的效果[3],因此具有较高的开发价值。

中药配方颗粒是将中药饮片提取、浓缩制成的颗粒剂,用于临床中药配方[4]。鉴于它们失去了传统饮片的外观,难以区分和鉴别,其质量也不易评价[5-7]。目前对荆芥的研究主要集中在其挥发油的成分分析和含量测定上。但鉴于中药成分的复杂性,很难借助单一指标成分的含量测定来评价配方颗粒的整体质量。中药特征图谱是一种对中药质量进行整体控制的方法。能反映中药化学成分信息的全貌。它不仅能够鉴别成分类型,还能够评价中药质量的均匀性和稳定性[6-7]。

因此,构建中药配方颗粒指纹图谱能够反映其化学特征信息,对其质量控制具备重要意义,目前尚无荆芥穗颗粒指纹图谱的相关研究。本研究采取使用超高效液相色谱法(UPLC)构建了荆芥穗配方颗粒的指纹图谱;同时,构建了荆芥穗配方颗粒中特定成分胡薄荷酮的测定方法,旨在为荆芥穗配方颗粒的质量评价和应用予以参考。

1 设备与试剂试药

Waters ACQUITY UPLC H-Class,岛津2010AHT,安捷伦1260,BSA124S电子天平;XP26电子天平;超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);岛津 Wondasil C18(柱长为250 mm,柱内径为4.6 mm,粒径为5 μm);岛津 ShiMADZA C18-AQ(柱长为250 mm,柱内径为4.6 mm,粒径为5 μm);Waters XBridge Shield RP 18(柱长为250 mm,柱内径为4.6 mm,粒径为5 μm);Waters CORTECS UPLC®T3(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)色谱柱。

荆芥穗对照药材(批号:121424-201404,中国食品药品检定研究院);胡薄荷酮对照品(批号:111706-201606,纯度99.8%,中国食品药品检定研究院);木犀草苷对照品(批号:111720-201609,中国食品药品检定研究院);迷迭香酸对照品(批号:111871-201706,中国食品药品检定研究院);咖啡酸对照品(批号:111885-200102,中国食品药品检定研究院);原儿茶酸(批号:110806-201906,中国食品药品检定研究院);原儿茶醛(批号:110810-201909,中国食品药品检定研究院);橙皮苷(批号:110721-202019,中国食品药品检定研究院);荆芥穗配方颗粒:KL-01、KL-02、KL-03、KL-04、KL-05、KL-06、KL-07、KL-08、KL-09、KL-10、KL-11、KL-12、KL-13、KL-14、KL-15、KL-16;甲醇(Merk);蒸馏水(屈臣氏);乙腈(Merk);甲酸、磷酸(Fisher Chemical);其他试剂为分析纯。

2 胡薄荷酮含量测定

2.1 荆芥穗配方颗粒挥发油中成分分析

采用气相质谱法对挥发油中的成分进行推断,结果见图1、表1。

表1 气相质谱主要峰推断表

结果显示:挥发油中含有薄荷酮、胡薄荷酮等成分。

进一步用气相色谱法对挥发油中的成分进行确认,结果见图2。

图2 荆芥穗配方颗粒挥发油气相色谱指认图

通过对照品指认,挥发油中主要含有薄荷酮及胡薄荷酮,其中胡薄荷酮在挥发油中的含量约为70%。

2.2 胡薄荷酮的测定

2.2.1 样品的配制

取荆芥穗配方颗粒,适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,称定质量,超声处理(功率250 W,频率50 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用70%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.2 对照品的配制

取胡薄荷酮对照品适量,加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液,即得。

2.2.3 色谱分析条件

按照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(V甲醇∶V水=70∶30,体积比)为流动相;检测波长为252 nm。理论板数按胡薄荷酮峰计算应不低于3 000。

2.3 方法学研究

2.3.1 专属性研究

取对照品溶液、配方颗粒溶液和阴性溶液进行检测(见图3),结果表明,样品中各个峰分离较好,阴性无干扰,表明该方法的专属性好。

A.荆芥穗配方颗粒溶液;B.胡薄荷酮对照品溶液;C.阴性溶液图3 荆芥穗配方颗粒溶液、胡薄荷酮对照品溶液及阴性溶液图谱

2.3.2 线性关系研究

取胡薄荷酮对照品适量,取8.100 mg,加70%甲醇定容至20 mL,作为母液(对照品溶液⑤)。分别取母液1,1,1,5 mL,加70%甲醇分别定容至100,50,10,10 mL。精密吸取上述5种对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,按正文方法测定胡薄荷酮色谱峰峰面积,以胡薄荷酮色谱峰的峰面积为纵坐标,胡薄荷酮的浓度为横坐标,得到回归方程为y= 3×107x+27 014,r= 0.999 9,表明胡薄荷酮在0.004 05～0.405 mg/mL范围内有较好的线性。

2.3.3 重复性研究

取荆芥穗配方颗粒,按照“2.2.1”项下样品溶液的配制方法配制6份样品溶液,精密取10 μL,测定,胡薄荷酮的含量平均值为5.9 mg/g,RSD=0.6%,结果显示方法重复性较好。

2.3.4 加样回收研究

取已知含量的同一批样品各0.25 g,精密称量9份,分别添加低中高三个浓度的胡薄荷酮对照品,按照“2.2.1”项下样品溶液的配制方法制备9份样品溶液,精密取10 μL测定,计算加样回收率,平均回收率为95.4%,RSD=3.2%,结果显示方法准确度较好。

2.3.5 稳定性研究

取荆芥穗配方颗粒,按照“2.2.1”项下样品溶液的配制方法制备样品溶液,分别于制备后0～24 h,间隔2 h取样,精密取10 μL测定,记录峰面积,其峰面积的RSD=1.9%,结果显示溶液24 h内稳定性较好。

2.3.6 耐用性研究

考察不同柱温、不同色谱柱、不同波长及不同流速对本检测方法的耐用性,结果见表2。各色谱条件发生微小变化时,本方法能满足试验要求,耐用性较好。

表2 耐用性试验结果表

2.3.7 样品含量检测

按照“2.2.1”项下样品溶液的配制方法配制样品溶液,测定胡薄荷酮含量,结果如表3。16批荆芥穗配方颗粒胡薄荷酮含量为3.41～6.44 mg/g。

表3 16批荆芥穗配方颗粒中胡薄荷酮含量

3 特征图谱的建立

3.1 参照物的配制

取荆芥穗对照药材2 g,加水25 mL,煮沸20 min,滤过,同样品溶液配制方法制备,作为对照药材参照物溶液。另取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草苷对照品适量,加甲醇分别制成每1 mL含0.1 mg的溶液,作为对照品参照物溶液。

3.2 样品的配制

取荆芥穗配方颗粒适量,研细,取约0.5 g,置具塞锥形瓶中,加水20 mL,超声处理30 min,放冷,用乙酸乙酯振摇提取两次,每次30 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加30%甲醇使溶解并定容至10 mL,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

3.3 色谱条件

以CORTECS UPLC T3(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)为色谱柱;以乙腈为流动相A,0.1%磷酸为流动相B,按表4梯度进行洗脱;流速为0.4 mL/min;柱温为35 ℃;检测波长为270 nm。理论板数按咖啡酸峰计算应不低于3 000。

表4 梯度洗脱表

3.4 方法学研究

3.4.1 精密度研究

取“3.1”项下的对照品参照物溶液,在“3.3”项条件下连续进样6次,计算相对峰面积和相对保留时间,RSD均在5%以内,结果显示仪器精密度较好。

3.4.2 重复性研究

取荆芥穗配方颗粒,按“3.2”项方法配制6份样品溶液,在“3.3”项色谱条件下分别测定,计算相对峰面积和相对保留时间,RSD均在5%以内,结果显示方法重复性较好。

3.4.3 稳定性研究

取同一批荆芥穗配方颗粒,按“3.2”项方法制备样品溶液,“3.3”项色谱条件下,分别于0～24 h,每间隔2 h取样进行测定,计算相对峰面积和相对保留时间,RSD均在5%以内,结果显示溶液在24 h内稳定性较好。

3.5 特征图谱中成分质谱推断解析及共有峰指认

特征峰的推断:取“3.2”项下制备的样品溶液,按“3.3”色谱条件,利用高效液相串联高分辨飞行时间质谱仪获得其质谱图,并根据质谱图对10个特征峰进行结构推断,推断结果见图4、表5。

表5 特征峰质谱推断结果

图4 荆芥穗配方颗粒质谱图

利用高效液相串联高分辨飞行时间质谱仪对荆芥穗配方颗粒中各特征峰分析,确定了9个特征峰的分子式,推断了6个特征峰:峰2推断为原儿茶酸,峰4推断为原儿茶醛,峰6推断为咖啡酸,峰7推断为木樨草甘,峰9推断为橙皮苷,峰10推断为迷迭香酸。

特征峰的确认:取原儿茶酸、原儿茶醛、橙皮苷、咖啡酸、迷迭香酸、木犀草苷对照品适量,精密称取,加甲醇分别制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液,作为对照品参照物溶液。

取荆芥穗配方颗粒与6个对照品溶液,检测,结果见图5。

图5 特征峰确认图

通过对照品指认,最终对6个特征峰进行归属确认:其中峰2为原儿茶酸,峰4为原儿茶醛,峰6为咖啡酸,峰7为木樨草甘,峰9为橙皮苷,峰10为迷迭香酸。

3.6 随行药材测定

随行药材测定结果见图6。

图6 荆芥穗配方颗粒与对照药材图谱对比

由图6可以看出,荆芥穗对照药材与配方颗粒相比较,特征峰保留时间一致峰形峰数统一,可为标准研究制定提供可靠依据和参考。

3.7 特征图谱的构建

分别取16批荆芥穗配方颗粒,按“3.2”项下样品溶液配制方法制备,再按“3.3”色谱条件进行测定,使用《特征图谱相似度评价系统》(2012版本)。得出荆芥穗配方颗粒对照图谱R(图7)和16批荆芥穗配方颗粒的重叠特征图谱(图8),并进行共有峰的标记,最终共标记10个共有峰。

图7 荆芥穗配方颗粒对照图谱

图8 16批荆芥穗配方颗粒的特征图谱

3.8 特征图谱共有峰相对保留时间的规定

由16批荆芥穗配方颗粒特征图谱可知,各特征峰相对保留时间差异较小,均在5%范围内,符合质量控制的要求,以咖啡酸为S峰,各峰的相对保留时间为:0.41(峰1),0.43(峰2),0.58(峰3),0.61(峰4),0.65(峰5),1.00(峰6S),2.65(峰7),3.09(峰8),3.32(峰9),3.43(峰10)。允许误差范围为:±10%。

4 讨论

中药配方颗粒保留了原饮片的药效和性状,具备不煎煮、调剂容易、贮藏方便、服用、携带、患者运输方便等特点。借助大量的临床实验和患者的亲身体验,其疗效与传统汤剂基本相同。与预想不同的是,目前市场上流通的中药配方颗粒规格并不统一,产品质量也存在较大差异。因此,构建统一的标准是不可或缺和合理且正确的。

研究表明,荆芥穗的主要成分是挥发油,挥发油的主要成分是胡薄荷酮。因此,本研究将测定胡薄荷酮的含量认为是控制荆芥穗颗粒剂的方法之一。鉴于中草药成分复杂,中草药及中药饮片制成配方颗粒后失去了药性,应当需要构建特异性强的特征图谱,客观评价荆芥穗产品质量,因此,本实验使用超高效液相色谱法构建了荆芥配方颗粒的特征图谱,为荆芥配方颗粒的质量控制和评价予以参考。中药指纹图谱能更全面地反映中药所含化学成分的种类,更易于控制其质量[8-9]。从16批次荆芥穗配方颗粒的UPLC指纹图谱可以看出,相似度大于0.90,鉴定出原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、木犀草素、橙皮苷、迷迭香酸的峰归属,指纹图谱相似度高,方法稳定性好,可用于控制荆芥颗粒配方颗粒的产品质量。