石玉喆,闫晓鑫,张志强,周永康*

(1.北京康仁堂药业有限公司,北京 101301;2.中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心,北京 101301;3.北京市中药配方颗粒工程技术研究中心,北京 101301)

石楠藤为蔷薇科植物石楠PhotiniaserrulataLindl.的干燥带叶的茎枝。味辛、甘,性温,入肝经,用于祛风止痛,壮筋骨,主治风痹疼痛,腰膝酸软等症[1]。石楠藤作为各地方常用品种,各地方标准对其收载项目简单、质量评价指标较少,尚不可全面反映石楠藤的药材质量。中药传统用药采用的是水煎煮汤剂的形式,故水溶性成分为其发挥临床药效的物质基础,经文献调研可知,石楠藤中含皂苷、野樱皮苷、熊果酸、齐墩果酸、挥发油等化学成分[2-3],根据研究发现石楠藤中含有大量绿原酸,现代药理学研究表明熊果酸、齐墩果酸、绿原酸有显著的抗炎、抗肿瘤、促进免疫、保肝、止疼、强心等药理作用[4-7],且均具有较好的水溶性,这与石楠藤祛风止痛作用密切相关,是其发挥临床药效的物质基础。目前关于石楠藤的研究仅有少量文献报道,且主要为石楠藤中熊果酸和齐墩果酸的相关研究[8],未见对其活性成分绿原酸的研究,因此该研究选择以绿原酸作为研究对象进行配方颗粒生产过程质量控制更符合临床的要求,能够保证用药的有效性。

中药配方颗粒是以传统中药饮片为原料,经过提取、浓缩、干燥、制粒等生产工艺,加工制成的一种统一规格、剂量、质量标准的新型配方用药[9]。在中医理论指导下使用,与传统中药汤剂相比,具有服用方便、易贮藏、便携带、质量可控等特点。标准汤剂作为配方颗粒的基准物质,用以衡量中药配方颗粒与临床汤剂的一致性[10],其质量参数是分析饮片-标准汤剂-配方颗粒相关性的依据,能够阐明物质传递的情况,从而保证药效成分的有效转移。

近年来,对于石楠藤的研究多侧重于化学成分及药理作用的研究,未见石楠藤饮片-标准汤剂-配方颗粒的质量相关性研究,以现有的研究基础并不能对饮片-标准汤剂-配方颗粒的相关性进行分析。故本研究以石楠藤中水溶性药理活性成分为研究对象建立含量测定及特征图谱方法,采用特征图谱与含量转移率相结合的模式,分析饮片-标准汤剂-配方颗粒的相关性,阐明物质传递情况,为中药配方颗粒生产全过程的质量控制提供参考,也为后续的质量标准研究提供实验依据。

1 仪器及试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC®H-Class超高效液相色谱仪,PDA Detector检测器;岛津LC-20,TUV Detector检测器,Empower 3色谱工作站;Waters CORTECS®UPLC®T3(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)色谱柱(美国Waters公司);KQ-300DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ME104E电子天平(梅特勒·托利多);JY20002电子天平(梅特勒·托利多);LGJ-50FD真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

1.2 试药及试剂

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110753-202018,纯度,96.1%);乙腈为色谱纯购于美国Merk公司;水为屈臣氏蒸馏水;石楠藤药材分别购于广东省佛山市、广东省江门市、汕头市等,药材经北京康仁堂药业有限公司质量检测中心鉴定为蔷薇科植物石楠PhotiniaserrulataLindl.的干燥带叶茎枝,由北京康仁堂药业有限公司按《北京炮制规范》2008年版石楠藤饮片项下的炮制方法加工制成石楠藤饮片,经检验均符合《北京炮制规范》(2008年版)规定。样品来源见表1。

表1 材料来源

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 石楠藤标准汤剂的制备

取石楠藤饮片200 g于砂锅中,浸泡30 min,一煎加饮片量8倍水,武火(500 W)煮沸后,文火煎煮30 min,趁热过滤(150目滤布),迅速冷却,备用;二煎加饮片量6倍水,武火煮沸后,文火(200 W)煎煮20 min,趁热过滤(150目滤布),迅速冷却备用;合并滤液,浓缩(65 ℃以下,真空度-0.1 MPa),浓缩至料液比约为1∶1(相对密度为1.05～1.10),冷冻干燥,密封保存,即得。

2.1.2 石楠藤配方颗粒的制备

取石楠藤饮片9 000 g,加水煎煮,滤过,滤液浓缩成清膏,干燥(或干燥、粉碎),再加入辅料适量,混匀,制粒,制成1 000 g,即得。

2.2 含量测定方法

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(内径2.1 mm,柱长100 mm,粒径1.6 μm)为色谱柱;以乙腈为流动相A,0.5%乙酸为流动相B,按表2中的规定进行梯度洗脱;检测波长为320 nm;柱温30 ℃;流速0.3 mL/min。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于4 000。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品适量,精密称定,加30%甲醇制成每1 mL含绿原酸0.487 mg的溶液,摇匀,作为对照品贮备液。

2.2.3 供试品溶液制备

饮片、标准汤剂及配方颗粒供试品溶液的制备:取本品适量,研细,分别取约0.5,0.2,0.2 g,精密加入体积分数为30%甲醇25 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,取出,放冷,再称定质量,并补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度试验

精密称取同一批次石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液,分别进样6次测定绿原酸峰面积,石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉的配方颗粒中绿原酸含量的RSD值分别为0.3%,1.2%,0.7%,表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 线性试验

精密吸取对照品贮备液5,1,1,1 mL,分别转移至10,10,50,100 mL容量瓶中,加体积分数为30%甲醇至刻度,质量浓度分别分4.873,9.746,48.728,243.638,487.275 μg·mL-1,进样测定得各峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,计算得回归方程为y=18 206x-9 264.9,R=1.000 0,表明绿原酸在4.873～487.275 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.4.3 重复性试验

精密称取石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液各6份,进样测定绿原酸峰面积,石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉的配方颗粒中绿原酸含量的RSD值分别为1.1%,1.2%,1.6%,表明重复性良好。

2.2.4.4 中间精密度试验

精密称取石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液各6份,采用不同仪器,不同人员,不同时间进样测定绿原酸峰面积,计算得其RSD值分别为0.4%,1.7%,1.9%,表明中间精密度良好。

2.2.4.5 稳定性试验

精密称取同一批次的石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液,分别于第0,2,4,8,10,12,24 h进样,测定绿原酸峰面积,石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒中绿原酸含量的RSD值分别为1.2%,1.0%,1.5%,结果表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.4.6 准确度试验

精密称取石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒各9份,分别精密加入与其相当量50%,100%,150%的绿原酸对照品,各平行三份,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液,测定含量,计算得绿原酸的平均回收率分别为101.84%,102.00%,96.18%,RSD值分别为2.0%,1.8%,1.0%,符合方法学验证回收率要求,表明该方法测得的结果准确。

2.2.5 含量测定

分别对20批石楠藤饮片、标准汤剂及3批配方颗粒按照上述方法测定绿原酸含量,并计算其转移率,结果如表3所示。

表3 含量及转移率汇总结果

2.3 特征图谱方法

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验

同2.2.1项下含量测定方法。

2.3.2 参照物溶液的制备

同2.2.3中饮片供试品溶液的制备方法,制备对照药材参照物溶液。另取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量,精密称定,分别加30%甲醇制成每1 mL分别含0.10,0.05,0.05 mg的溶液,摇匀,作为对照品参照物溶液。

2.3.3 供试品溶液制备

饮片、标准汤剂及配方颗粒供试品溶液制备方法同2.2.3中制备方法。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 精密度试验

精密称取同一批次石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液,分别进样6次记录其特征图谱,以绿原酸为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积可知,相对保留时间RSD均为0.0%～0.2%,相对峰面积RSD分别为0.0%～0.8%,0.0%～0.7%,0.0%～1.2%,表明仪器精密度良好。

2.3.4.2 重复性试验

精密称取石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液各6份,记录其特征图谱,以绿原酸为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积可知,相对保留时间RSD分别为0.0%～0.4%,0.0%～0.8%,0.0%～0.9%,相对峰面积RSD分别为0.0%～1.9%,0.0%～1.4%,0.0%～2.0%,表明该方法重复性良好。

2.3.4.3 中间精密度试验

精密称取石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.2.3项下方法制备供试品溶液各6份,采用不同仪器,不同人员,不同时间进样,记录其特征图谱,以绿原酸为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和峰面积可知,相对保留时间RSD分别为0.0%～0.6%,0.0%～0.1%,0.0%～0.1%,相对峰面积RSD分别为0.0%～0.1%,0.0%～1.9%,0.0%～0.4%,不同仪器间相对保留时间RSD分别为0.0%～1.8%,0.0%～2.0%,0.0%～1.9%,相对峰面积RSD分别为0.0%～5.2%,0.0%～6.4%,0.0%～8.1%,表明该特征图谱在不同仪器间相对保留时间符合分析要求,不同仪器间相对峰面积差异较大。表明中间精密度良好。

2.3.4.4 稳定性试验

精密称取石楠藤饮片、标准汤剂冻干粉及配方颗粒适量,按照2.1.3项下方法制备供试品溶液,分别于第 0,2,4,6,8,10,12,24 h进样,记录其特征图谱,以绿原酸为参照峰,计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积可知,相对保留时间RSD分别为0.0%～0.7%,0.0%～0.8%,0.0%～1.4%,相对峰面积RSD分别为0.0%～1.5%,0.0%～2.5%,0.0%～2.0%,结果表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.3.4.5 特征图谱的测定

分别对20批石楠藤饮片、标准汤剂及3批配方颗粒按照特征图谱方法测定,将所得到的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2012A),用多点校正将谱峰自动匹配,平均数法计算得出样品指纹图谱的共有模式,经比较分析后确定石楠藤饮片、标准汤剂、配方颗粒均有6个共有峰,结果见图1～3,表明石楠藤饮片、标准汤剂和配方颗粒整体相似性较高。6个共有峰均峰面积较大且峰型较好,能够有效表征石楠藤内在质量的整体变化,故将6个共有峰作为特征图谱的特征峰,同时指认了峰1为新绿原酸,峰3为绿原酸,峰5为隐绿原酸,见图4。

图1 20批石楠藤饮片特征图谱

图2 20批石楠藤标准汤剂特征图谱

峰1:新绿原酸;峰3(S):绿原酸;峰5:隐绿原酸

图4 共有峰指认

2.4 质量相关性分析

石楠藤饮片中绿原酸含量范围为0.5～2.3 mg·g-1;标准汤剂含量范围为2.4～7.3 mg·g-1,转移率范围为12.0%～47.6%;配方颗粒含量分别为2.5,2.8,2.6 mg·g-1,转移率分别为24.1%,35.1%,20.0%,由以上结果可知,配方颗粒绿原酸含量及含量转移率均在标准汤剂所测得的均值±3SD范围内,说明饮片-标准汤剂-配方颗粒制备过程中工艺成熟、稳定,能够保证配方颗粒的临床药效。

石楠藤饮片、标准汤剂、配方颗粒UPLC对照指纹图谱相似度结果见表4。由图5及表4可知,在饮片、标准汤剂、配方颗粒中5个特征峰传递良好,石楠藤饮片、标准汤剂与配方颗粒对照指纹图谱相似度均大于0.990,说明石楠藤配方颗粒和饮片、标准汤剂主要化学成分基本一致。

图5 石楠藤饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱

表4 石楠藤饮片、标准汤剂、配方颗粒对照指纹图谱的相似度结果

3 讨论

石楠藤中含皂苷、野樱皮苷、熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、挥发油等化学成分,其中绿原酸具有抗炎、止疼的药理活性,是石楠藤发挥临床药效的物质基础之一,其同分异构体为新绿原酸和隐绿原酸,受温度、pH值及化合物中不稳定结构的影响,通过水解和分子内酯基迁移而易发生同分异构体之间的转化[11-15],因此选择绿原酸作为定量指标,以新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸为定性指标进行过程质控具有一定意义。建立的含量测定和特征图谱方法经方法学验证,重复性、中间精密度、稳定性考察RSD均小于3.0%;绿原酸含量测定其平均回收率结果均大于90.0%,RSD均小于3.0%,且绿原酸在4.873～487.275 μg·mL-1范围内线性关系良好,表明建立的含量测定和特征图谱方法准确、可行。故本研究所建立的含量测定和特征图谱方法能够对石楠藤饮片、标准汤剂以及配方颗粒进行有效的质量控制。

基于建立的质量控制方法,对石楠藤饮片、标准汤剂以及配方颗粒进行相关性分析,结果显示在饮片-标准汤剂-配方颗粒制备过程中药效成分损失较小,配方颗粒转移率均符合标准汤剂范围,且各批次石楠藤特征图谱中特征峰均传递良好,饮片、标准汤剂及配方颗粒相似度达0.9以上,表明石楠藤饮片-标准汤剂-配方颗粒物质传递过程稳定,主要化学成分基本一致,三者具有良好的相关性。

因此,本研究针对石楠藤中水溶性药效成分建立含量测定和特征图谱方法,通过饮片-标准汤剂-配方颗粒相关性分析,实现了对配方颗粒生产过程的质量监控,阐明了物质传递情况,可为后续的质量标准研究提供实验及理论依据。