李世玺,刘雪,梁旭华,程敏

(商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000)

近年来癌症频发,每年都有数以百万计的患者死于癌症及相关疾病,对人类健康构成了极大的威胁[1]。在治疗癌症的众多方案中,化疗是最为常用的一种治疗方法[2]。然而很多化疗药物在杀灭癌细胞的同时也会对正常细胞和组织造成一定的毒副作用,影响了其在临床上的应用[3]。为了提高化疗药物的生物利用度和降低对患者的毒副作用,药物运载体系的研发受到了持续的关注[4]。由于具有独特的优势,生物刺激信号如酶、氧化还原、葡萄糖、pH值和温度已经被广泛地应用于响应性可控释放的药物载体的设计当中[5-7]。在这些生物刺激信号中,还原敏感性在药物载体设计中的应用格外引人注目[8-11]。正常体液中谷胱甘肽的浓度(2～20 μmol/L)远低于癌细胞中的(2～20 mmol/L)[12-13],利用其谷胱甘肽的浓度差异,通过在纳米载体结构中引入还原响应性结构或者官能团[14],可以制备具有还原响应性的药物运载体系。至今已经有一系列的还原敏感性纳米颗粒被用于药物运载体系的制备当中[15-24]。

综合利用开环反应(ROP)和原子转移自由基反应(ATRP),制备了一系列新型两亲性嵌段共聚物PLAn-SS-PHEMAm。聚合物可自组装成均一胶束,利用动态光散射仪(DLS)和透射电子显微镜(TEM)研究胶束的粒径尺寸和形貌,通过荧光蛋白法检测其临界胶束浓度。随后依次研究了其稳定性、血液相容性和细胞毒性。通过透析法阿霉素可以有效地负载于胶束内部而形成均一的载药胶束,考察了载药胶束的体外药物释放性能。

1 实验材料与方法

1.1 主要原料

实验所用试剂如无特别说明均购自国药集团化学试剂有限公司。2,2′-二硫代二乙二醇(SS-DOH,90%),甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA,97%)购于Acros公司。2-溴-2-甲基丙酸(98%)购于萨恩化学技术(上海)有限公司。溴化亚铜(CuBr,≥98.5%)、2,2′-联吡啶(bpy,≥99.5%)及二环己基碳二亚胺(DCC,≥ 95%)购自国药集团化学试剂有限公司。二甲氨基吡啶(DMAP)购于百灵威。辛酸亚锡(Sn(Oct)2,95%)购于阿拉丁。D,L-丙交酯(D,L-LA,≥99.0%)购于上海笛柏化学品技术有限公司。二硫苏糖醇(DTT,>98%)购自默克公司。阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)购自上海英轩公司。

DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗(青霉素-链霉素)购于Gibco公司。胎牛血清购于Hyclone公司。人类宫颈癌细胞(HeLa)来自中国典型培养物保藏中心(武汉)。SD大鼠(雄性,250 g)购于武汉大学中南医院。

1H NMR的检测由Mercury VX-300型核磁共振波谱仪于300 MHz下完成,常用溶剂为CDCl3或DMSO-d6,四甲基硅烷(TMS)作为内标。由Hitachi F-4500荧光光谱仪测定相关的荧光性质。聚合物胶束粒径及粒径分布由Malvern Zetasizer Nano ZS测定。胶束的形貌则利用JEM-100CX II透射电子显微镜观察,加速电压为100 kV。聚合物的相对分子质量及分布由Waters 2690D-2410 GPC凝胶色谱系统检测,采用Styragel脂溶性凝胶柱(Waters,Styragel HR3),检测参数为:流速为0.300 mL/min,柱温和显示器温度均为40 ℃,聚甲基丙烯酸甲酯作为标准品,DMF为溶剂。血红蛋白的吸光值经由紫外可见分光光度计(Perkin-Elmer,Lambda 35)来检测。细胞毒性则利用酶标仪(Bio-Rad 550,Hercules,CA,USA)进行测定。

1.2 两亲性聚合物的合成

1.2.1 PLA-SS-iBuBr与PLA-CC-iBuBr的合成

参考文献[24]方法合成HO-SS-iBuBr和HO-CC-iBuBr。利用HO-SS-iBuBr引发D,L-LA的开环反应制备PLA-SS-iBuBr:HO-SS-iBuBr(90.1 mg,0.3 mmol)、D,L-LA(3.0 g,20.8 mmol)、Sn(Oct)2(0.4 mL,0.04 mmol)和甲苯(2 mL)加入舒伦克管中。混合物通过三次“冷冻-抽换气-解冻”彻底除水除氧。将其在Ar气氛下加热至120 ℃进行聚合,反应8 h后冷却至室温通大气终止反应。聚合物用甲醇进行沉降,所得固体于40 ℃真空干燥24 h,即得白色粉末状中间体,产率86%。PLA-CC-iBuBr的合成参照上述方法,以HO-CC-iBuBr替代HO-SS-iBuBr,可得白色粉末状产物,产率81%。

1.2.2 PLA-SS-PHEMA与PLA-CC-PHEMA的合成

通过PLA-SS-iBuBr引发HEMA的ATRP反应制备PLA-SS-PHEMA:PLA-SS-iBuBr(0.50 g,0.083 mmol)、HEMA(0.87 g,0.8 mL,6.7 mmol)、联吡啶(26.04 mg,0.17 mmol)与CuBr(11.68 mg,0.083 mmol)投入舒伦克管,密封后通过抽放气除氧,加入2 mL甲苯/甲醇(V甲苯∶V甲醇=65∶35)使之溶解。混合物通过三次“冷冻-抽换气-解冻”彻底除水除氧。解冻后于70 ℃聚合,反应8 h后冷却至室温通大气终止反应。采用氧化铝柱层析法除催化剂,氯仿/甲醇作为洗脱剂。洗脱液浓缩后于乙酸乙酯/正己烷(V乙酸乙酯∶V正己烷=1∶1)混合液中沉降,所得白色固体于40 ℃真空干燥24 h即得目标产物,产率68%。PLA-CC-PHEMA的合成依照前述方法,以PLA-CC-iBuBr替代PLA-SS-iBuBr,得白色纯品,产率72%。

1.3 聚合物胶束的制备及性质表征

1.3.1 聚合物胶束的制备

透析法制备聚合物胶束:准确称取10 mg聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA,然后将其溶于2 mL DMSO,超声处理使之充分溶解。将适量去离子水缓慢滴加至有机相,室温继续搅拌2 h后移至透析袋(MWCO 3500),定时更换缸内去离子水,透析24 h得PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA的胶束溶液。利用动态光散射仪(DLS)测定聚合物胶束的粒径和粒径分布,胶束的形态则通过透射电子显微镜(TEM)检测观察。

1.3.2 临界胶束浓度的测定

利用荧光光谱法[23-24]测定聚合物的临界胶束浓度(CMC):分别精确量取3 μL芘(浓度为6.26×10-4mol/L)的丙酮溶液,加入到一系列的样品瓶中,于55 ℃的烘箱内避光放置使溶剂彻底挥发。将胶束溶液梯度稀释,分别取3 mL加入到处理过的样品瓶内,室温下避光静置过夜。利用荧光光谱仪来测试各样品中芘的发射光谱:激发波长334 nm,记录范围350～450 nm,狭缝宽度5 nm。以荧光发射光谱中的第三荧光峰的强度(I394)和第一荧光峰强度(I378)的比值(I394/I378)与聚合物浓度(LogC)的关系作图来确定聚合物的临界胶束浓度。

1.3.3 溶血实验

静脉注射是纳米药物的主要给药方式,纳米颗粒需具备极高的血液相容性。采用溶血实验来评价聚合物胶束的血液相容性。参考文献[21]制备2%红细胞悬浮液。

溶血率的检测:取0.2 mL不同浓度梯度(0.25～5.0 mg/mL)聚合物胶束于EP管,分别加入0.8 mL的2%细胞悬浮液和1.0 mL的PBS,作为实验组。以去离子水作为阳性对照组,而以PBS作为阴性对照组。实验组和对照组于37 ℃孵育2 h,于1 500 r/min离心15 min,收集上清液,于室温静置30 min。阴性对照组为空白,通过紫外可见分光光度计检测各上清液540 nm处吸光值,按如下公式计算各样品的溶血率:

式中:ASample为实验组各样品上清液540 nm处吸光值,APositive和ANegetive分别为阳性和阴性对照组上清液540 nm处吸光值。每个样品分别做三个平行样。

1.3.4 胶束的细胞毒性测定

采用MTT法检测聚合物胶束对HeLa细胞的毒性:以5.0×103细胞/孔的密度将HeLa细胞种到96孔板,在含5% CO2培养箱中于37 ℃孵育24 h。使用完全DMEM培养基将PLA-SS-PHEMA或PLA-CC- PHEMA胶束溶液逐级稀释至不同浓度梯度。分别取100 μL不同浓度梯度胶束溶液加入到预先种有HeLa细胞的96孔板(对照组只加入100 μL完全DMEM培养基),于37 ℃孵育48 h。每孔中加入20 μL MTT,于37 ℃孵育4 h后移除孔内MTT及培养基,每孔加入150 μL DMSO,室温轻柔振荡使蓝紫色的晶体甲瓒彻底溶解。利用酶标仪测定各孔在570 nm处吸光值。细胞相对存活率(Relative Cell Viability)可以通过以下公式计算:

式中:A0为背景值(未加胶束及MTT),Acontrol为对照值(未加胶束而只加MTT),Atest则是含不同浓度胶束的各孔的实验值。每个浓度的胶束溶液和对照组做4个平行样。

1.3.5 胶束的细胞毒性测定

透析法制备载药胶束:将DOX·HCl(5 mg)和三乙胺(10 μL)溶于10 mL的DMSO,避光搅拌,加入50 mg PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA,继续搅拌2 h。将25 mL去离子水缓慢滴加到混合液,继续搅拌2 h后转移至透析袋(MWCO 3500),定时更换透析缸内去离子水,于室温透析48 h即得聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA载药胶束。将其用0.45 μm水系滤膜过滤,可得粒径均一的载药胶束。载药胶束的粒径及粒径分布通过动态光散射测试方法测定。

取3 mL载药胶束冻干,用DMSO溶解,利用荧光光谱仪测定590 nm处的发射光强度:激发光的波长为485 nm,记录范围400～650 nm,狭缝宽度为5 nm。依据所制的DOX/DMSO的标准曲线来计算胶束中DOX含量。胶束载药量(Drug lLoading Content,DLC)及包封率(Entrapment Efficiency,EE)通过如下公式计算:

式中:Wdrug为聚合物胶束包载的药物质量;Wmicelle为冻干后胶束质量;Wfeed为初始药物质量。

1.3.6 载药胶束的体外还原响应性释放

以PLA-SS-PHEMA的载药胶束(SS-DOX)为实验组,PLA-CC-PHEMA的载药胶束(CC-DOX)和游离DOX(Free DOX)作为对照组。模拟体外还原性环境(含10 mmol/L DTT的PBS,0.01 mol/L,pH值7.4)和非还原性环境(无DTT的PBS,0.01 mol/L,pH值7.4),研究载药胶束的释药性能:三种溶液各取1 mL移至透析袋(MWCO 3500),密封后浸入30 mL相应的缓冲溶液中,于37 ℃恒温振荡(100 r/min)。定时从各体系分别取出5 mL的缓冲液,并补加相同体积相应的新鲜缓冲液,体系中缓冲液的总体积不变。通过荧光光谱法测定所取样品的DOX含量。样品中药物的累积释放量(Cumulative Release)依据如下公式计算:

式中:Wt为时间t时从载药胶束中释放的药物质量的总和,Wdrug为各载药胶束中所含药物的初始质量。以药物释放时间作为横坐标,药物累积释放量作为纵坐标绘制曲线图。每种缓冲体系分别做三个平行样。

2 实验结果与讨论

2.1 聚合物的合成与表征

两亲性嵌段聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA的合成路线如图1所示。参考文献[24]方法合成小分子引发剂HO-SS-iBuBr和HO-CC-iBuBr。分别利用其羟基引发D,L-丙交酯的开环反应,制得大分子引发剂PLA-SS-iBuBr和PLA-CC-iBuBr。大分子引发剂引发HEMA单体的ATRP反应,制备聚合物PLA-SS-PHEMA或PLA-CC-PHEMA。通过调节HEMA单体和大分子引发剂的投料比控制疏水性链段(PLA)和亲水性链段(PHEMA)的长度比例。

图1 两亲性聚合物的合成路线

聚合物相对分子质量利用GPC检测。以还原敏感性嵌段共聚物为例,固定疏水性链段的长度,通过控制HEMA单体和大分子引发剂的投料比例来调节亲水性链段长度,制备一系列两亲性嵌段共聚物PLAn-SS-PHEMAm。将其用作抗肿瘤药物阿霉素的载体材料,考察载药胶束粒径、载药量及包封率等相关性质(表1所示)。随着聚合物的亲水性链段长度的增长,胶束的粒径有所增大,而亲水性链段长度达到一定限度(n∶m=2∶7)后便无法形成胶束。此外,随着亲水性链段的增长,聚合物胶束的载药率有所下降。综合考虑聚合物胶束的稳定性和载药率等性质,选择聚合物PLAn-SS-PHEMAm(Mn=2.52×104,n∶m=2∶3)进行后续研究。而PLAn-CC-PHEMAm(Mn=2.61×104,n∶m=2∶3)与前者相对分子质量非常接近,因此可以作为对照组。

表1 两亲性聚合物胶束性质及载药性能

图2为PLA-SS-iBuBr及PLA-SS-PHEMA的1H NMR谱图。图2(A)中δ=5.14～5.26和δ=1.55～1.59分别为PLA中O=C-CH(CH3)-OH和-CH3特征峰,峰面积的积分比为1∶3;δ=1.94处单峰则属于溴代异丁酸酯上甲基的质子峰。图2(B)中可找到PLA的特征峰,PHEMA中羟基特征峰出现在δ=4.82处,而δ=3.89和δ=3.58处则是亚甲基的特征峰,其余的峰也都有归属,且各峰面积的积分比例也都符合要求,证明聚合物PLA-SS-PHEMA的成功合成。

(A)PLA-SS-iBuBr(溶剂:CDCl3);(B)PLA-SS-PHEMA(溶剂:DMSO-d6)图2 聚合物的1H NMR谱图

2.2 聚合物胶束的制备和表征

以芘作为荧光探针来测定两亲性聚合物的临界胶束浓度(CMC)。以荧光发射光谱中的第三荧光峰值(I394)和第一荧光峰值(I378)的比值与聚合物浓度(LogC)的关系作图(图3)。

图3 芘荧光光谱(I394/I378)与聚合物PLA-SS-PHEMA浓度(LogC)的关系曲线图

聚合物浓度较低时,I394/I378值基本上保持不变,超过某一浓度时,开始急剧增大,拐点处分别作切线,交点所对应浓度即为临界胶束浓度。从图3可算出PLA-SS-PHEMA的CMC为9.7 μg/mL。极低的临界胶束浓度表明其在体内循环过程中能够保持较长时间的稳定性,为其用于构建抗癌药物递送体系提供了保证。

采用动态光散射法测定聚合物胶束和载药胶束的粒径尺寸和粒径分布,进一步利用透射电镜表征其形貌(图4)。

(A,B)聚合物PLA-SS-PHEMA空白胶束;(C,D)载药胶束

从图4(A)看出聚合物PLA-SS-PHEMA胶束的粒径呈现单分散性,分布较窄,其粒径平均尺寸为96 nm,符合抗癌药物载体的要求。TEM结果(图4 B)进一步证明聚合物胶束具有较规则的球形轮廓,粒径尺寸约70 nm。从图4(C,D)看出聚合物载药胶束的粒径有所增大。相较于DLS检测结果,TEM法检测的胶束粒径尺寸较小,可能是因为在制样过程中聚合物胶束经历了干燥过程,亲水性外壳发生坍塌从而造成了尺寸的缩减。

2.3 聚合物胶束的溶血实验和细胞毒性实验

静脉注射是纳米药物颗粒的主要给药方式,这对纳米颗粒的血液相容性提出了很高的要求。本文通过溶血实验来考察聚合物胶束的血液相容性。从图5可知,在0.25～5.0 mg/mL的质量浓度范围内,PLA-SS-PHEMA胶束和PLA-CC-PHEMA胶束的溶血率均维持在2%左右,在国家标准允许的范围之内(不超过5%)。这两种聚合物胶束均符合生物医用材料溶血实验要求。从图5溶血实验照片可知,在0.25～5.0 mg/mL的质量浓度范围内,经这两种聚合物胶束处理的试样,其上清液均为无色透明状,未被破坏的红细胞沉积在EP管底部。而阳性对照组的上清液则为明显的红色,EP管底部未见有沉积的红细胞,表明红细胞已被去离子水严重破坏,导致了溶血现象。实验结果进一步说明这两种聚合物胶束具有良好的血液相容性,可以用于体内注射。

插入图片:实验组(聚合物胶束)、阳性对照组(去离子水)、阴性对照组(PBS 7.4)的红细胞溶血实验结果,A:PLA-SS-PHEMA,B:PLA-CC-PHEMA图5 不同浓度聚合物胶束处理过的红细胞溶血率(mean ± SD,n=3)

为评价聚合物材料的毒性,选取HeLa细胞作为模型细胞,采用MTT法检测聚合物胶束的细胞毒性。从图6可以看出,在1.95～250 μg/mL的质量浓度范围内,与还原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA胶束及非还原敏感性聚合物PLA-CC-PHEMA胶束共培养的肿瘤细胞存活率均在90%以上,表明这两种聚合物对肿瘤细胞毒性极低,适于用作药物载体材料。

图6 PLA-SS-PHEMA和PLA-CC-PHEMA空白胶束与HeLa细胞共培养48 h后细胞毒性(mean ± SD,n=4)

2.4 空白胶束DLS分析及还原刺激响应性研究

聚合物PLA-SS-PHEMA结构中的双硫键在还原性条件下发生断裂,导致聚合物解体。通过体外模拟还原性环境,采用DLS法研究聚合物胶束的粒径尺寸及分布随时间的变化。

从图7可以看出,在非还原性条件(不含DTT的PBS缓冲液)下,还原响应性聚合物PLA-SS-PHEMA胶束作用24 h后,其粒径几乎没有变化。而在模拟的还原性环境(含10 mmol/L DTT的PBS缓冲液)中作用10 min,聚合物胶束粒径就发生了变化,出现了两个峰。聚合物胶束在还原性条件下迅速降解,致使其粒径尺寸及分布发生巨大变化。当作用时间延长至20 min,胶束的粒径尺寸激增,表明其结构遭到进一步的破坏。作为对照组的PLA-CC-PHEMA胶束在相同的还原性条件下作用24 h,粒径尺寸及分布依然稳定。研究结果表明聚合物PLA-SS-PHEMA具有灵敏的还原响应性,为其载药胶束的还原响应性释药提供了可能性。

(A)PLA-SS-PHEMA胶束;(B)PLA-CC-PHEMA胶束

2.5 载药胶束的制备与表征

阿霉素是一种广谱抗肿瘤药物,被广泛应用于癌症的临床治疗。鉴于阿霉素本身具有荧光,本研究以阿霉素作为模型药物,采用透析法制备载药胶束。通过荧光光谱法测定还原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA的载药量为5.7%,包封率为60.8%;非还原敏感性聚合物PLA-CC-PHEMA的载药量为5.4%,包封率为56.6%。

体外模拟还原性环境(PBS含10 mmol/L DTT,pH值7.4)和非还原性环境(PBS,pH值7.4),研究这两种载药胶束的药物释放情况。从图8可以看出,游离DOX在PBS中出现暴释,不到1 h就有近80%的药物释放出来。在还原性条件下,还原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA的双硫键发生断裂而破坏胶束结构,迅速释放胶束内核负载的DOX,仅10 h就有约30%的DOX释放出来,随着释药时间的增长,累积释药量可达到90%。而非还原敏感性聚合物PLA-CC-PHEMA载药胶束在还原性和非还原性条件下释药速率都比较低,其释药情况无显著性差别,释药时间延长至48 h,其累积释药量均不超过30%。鉴于还原敏感性聚合物PLA-SS-PHEMA载药胶束可以实现灵敏的还原响应性药物释放,其在构建抗癌药物运载体系方面具有一定的应用潜力。

(A)PLA-SS-PHEMA胶束;(B)PLA-CC-PHEMA胶束图8 PLA-SS-PHEMA胶束和PLA-CC-PHEMA胶束在不同条件下的体外DOX释放(mean ± SD,n=3)

3 结论

利用开环反应和原子转移自由基聚合反应合成一系列新型还原敏感性两亲性嵌段共聚物PLAn-SS-PHEMAm。聚合物可以自组装成规则的球形纳米胶束,有效地负载抗癌药物DOX。研究表明n∶m=2∶3时聚合物胶束的粒径和载药性能最佳。聚合物材料的细胞毒性极低,能够满足纳米药物载体材料的安全性要求。鉴于聚合物胶束优良的血液相容性,可以用于体内注射。还原性环境中聚合物载药胶束的双硫键发生断裂,胶束解体而快速释放负载的DOX。因此,该还原敏感性聚合物有望用于抗肿瘤药物递送领域,以解决传统抗肿瘤药物制剂存在的问题。