徐聪玲，钟世欢，张思奇，黄 南，杨天明，王 辉

1 浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009

2 赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009

关键字：酵母β-葡聚糖；离子色谱仪；乳制品；葡萄糖

0 引言

酵母β-葡聚糖具有增强动物免疫力、抗肿瘤、抗感染、降低胆固醇、促进伤口愈合等功能，2010年5月20号，被原卫生部批准为新资源食品，可添加到乳制品、功能饮料、焙烤制品、糖果等食品中；2012年使用范围再次扩大至较大婴儿配方乳粉。此外，酵母β-葡聚糖还具有脂肪样口感，可作为低卡路里食品添加剂，在色拉调料、奶酪类似物等冷冻甜点中作为脂肪替代物使用，具有广泛的应用价值，国内已有乳品企业将其作为营养强化剂添加在产品中。但国内目前没有酵母β-葡聚糖在乳制品中定量检测方法的国家标准和行业标准，因此，本文利用酵母β-葡聚糖是一种无味无臭不溶于水的多糖，且不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，可与蛋白、甘露聚糖或几丁质等物质结合[1]的特性建立了乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法。

1 材料和方法

1.1 仪器、试剂和材料

Thermo ICS 3000离子色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；3K15高速离心机，Sigma公司；AR223CN电子天平，奥豪斯（常州）仪器有限公司。

葡萄糖（C6H12O6）标准品（纯度≥99%），坛墨质检科技股份有限公司；酵母β-葡聚糖（C6H12O6）n原料（纯度≥80%），江苏佰耀生物科技有限公司；盐酸（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、氢氧化钠（分析纯），永华化学科技（江苏）有限公司；50%氢氧化钠溶液（w/w），上海安谱实验科技股份有限公司；钠型前处理小柱[填料为Na型强酸性阳离子交换树脂（Na）]；色谱柱（DionexCarboPac PA10 4mm×250 mm）、色谱柱（DionexCarboPac PA1 4mm×250 mm）、色谱柱（DionexCarboPac PA2003mm×250 mm），赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 样品预处理

沉淀蛋白：称取1～5 g（精确到0.0001 g）乳粉样品于离心管中，加入20 mL 60 ℃左右的水充分溶解，加入1 mL亚铁氰化钾溶液，再加入1 mL乙酸锌溶液，涡旋混匀，高速离心2 min（6 000 r/min以上），弃掉上清液，得到沉淀。

水洗：向沉淀中加15 mL 60 ℃左右的水，涡旋至完全溶解，高速离心，弃掉上清液（反复用水清洗离心，至最后1 遍上清液中不含干扰物质）。

酸水解：向沉淀中加入10 mL 1 mol/L盐酸溶液，121 ℃水解1 h，冷却至室温后用5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0～7.0，稀释定容至50 mL，用滤纸过滤，取滤液过钠柱后，用0.22 μm滤膜过滤上机；酵母β-葡聚糖标准品或原料须与样品同时酸水解，以便测得葡聚糖水解率。

空白试验：除不加试样外，其余处理同上。

1.3 溶液配制

（1）葡萄糖储备液：准确称取葡萄糖标准物质10 mg（精确至0.1 mg），用水溶解稀释后定容至10 mL。

（2）葡萄糖中间液：吸取葡萄糖储备液1 mL，用水溶解稀释后定容至10 mL。

（3）工作液：准确吸取适量葡萄糖中间液，用水溶解稀释后定容至浓度为1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL的系列工作液。

（4）亚铁氰化钾溶液：称取15.0 g亚铁氰化钾，用水溶解稀释后定容至100 mL。

（5）乙酸锌溶液：称取30.0 g乙酸锌，用水溶解稀释后定容至100 mL。

（6）氢氧化钠溶液（5 mol/L）：称取20.0 g氢氧化钠，用水溶解稀释后定容至100 mL。

1.4 仪器条件

色谱条件：流速：0.5 mL/min；进样量：2 μL；柱温：35 ℃。流动相：15 mmol/L氢氧化钠溶液[50%氢氧化钠溶液（w/w）配制]；等度洗脱。

检测器：脉冲安培检测器，Au工作电极，AgCl参比电极。

检测池温度：30 ℃。

1.5 结果计算

根据标准曲线计算得出对应的样品浓度C，由公式①计算出样品中被测物的含量：

其中X：样品中酵母β-葡聚糖含量，单位为mg/100 g；C：由标准曲线计算测得样品中葡萄糖浓度，单位为μg/mL；V：样品的最终定容体积，单位为mL；f：稀释倍数；m：称样量，单位为g；100：100 g样品中被测物含量；1 000：μg与mg之间转换系数；F：酵母β-葡聚糖水解校正因子，F=1/葡聚糖标准品水解率 。

其中0.9：葡萄糖转换为葡聚糖的系数；C1：酵母β-葡聚糖原料水解定容液上机测得的葡萄糖含量（g/mL）；V1：酵母β-葡聚糖原料水解后定容体积，单位为mL；W1：酵母β-葡聚糖质量，单位为g。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本试验考察了用于酵母β-葡聚糖检测的DionexCarboPac PA10 4×250 mm、DionexCarboPac PA14×250 mm和DionexCarboPac PA200 3×250 mm三种色谱柱上的最佳分离条件，试验结果表明，DionexCarboPac PA200 3×250 mm色谱柱上葡萄糖出峰时间太早。改用DionexCarboPac PA14×250 mm后，样品中葡萄糖的分离度不理想；而DionexCarboPac PA10 4×250 mm色谱柱在出峰时间及分离度都能满足检测要求。因此，试验选择DionexCarboPac PA10 4×250 mm色谱柱。

2.2 样品前处理条件的确定

2.2.1 水洗次数确定

本试验的研究对象是乳制品，乳制品中含有乳糖，且乳糖充分水解产物为葡萄糖和半乳糖，而酵母β-葡聚糖不溶于水，因此前处理通过沉淀剂得到粗沉淀后，用去离子水反复清洗，直至无干扰。再用1 mol/L盐酸121 ℃高压水解60 min，调节pH值稀释定容后，过钠柱，去除多余的金属离子。在酸水解、仪器条件一致的情况下，干扰物随着水洗次数增多而慢慢减少，直至水洗7 次后趋近为0。结果如图1所示，确定水洗次数不少于7 次。

图1 水洗次数对干扰物含量的影响

2.2.2 沉淀剂选择

根据表1试验结果，最后选择亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液沉淀蛋白。

表1 3 种沉淀剂对样品沉淀效果及检测结果的影响

2.3 方法标准曲线、线性范围及回收率

配制5水平的工作溶液，在选定的色谱条件下，以目标物峰面积为纵坐标、以目标物的浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程，结果如表2所示。在1 μg/mL，2 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数（R2）为0.99911。

表2 标准溶液曲线线性方程及相关系数

对某品牌乳粉、纯牛奶及浓奶进行加标回收试验，加入3 个不同浓度的酵母β-葡聚糖，每个浓度平行测定6 次，回收率结果见表3。酵母β-葡聚糖的平均回收率分别为81.5%～94.9%，相对标准偏差分别为0.80%～4.71%，本方法的准确度均满足试验分析要求。

表3 酵母β-葡聚糖平均加标回收率及相对标准偏差（n=6）

2.4 实际样品测定

已采用本方法对现有样品检测108 批次，检测结果满意（表4）。

表4 某品牌幼儿配方乳粉、液奶及浓奶中酵母β-葡聚糖的检测结果

2.5 标准品及样品图谱

标准品及样品图谱见图2、图3。

图2 标准品图谱

图3 样品图谱

3 结论

本文通过优化前处理条件及离子色谱条件，建立了乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法。根据酵母β-葡聚糖的特性，用沉淀剂沉淀蛋白，再用热水反复冲洗沉淀，将基质中水溶性杂质除掉，然后用一元酸在高温高压下将沉淀中目标物水解成葡萄糖，再用氢氧化钠溶液调节pH值后，定容。由于处理过程中用到的沉淀剂含有金属离子，对检测器及色谱柱都有影响。虽然氢氧化钠溶液沉淀一部分铁离子，但并不完全，因此，样液需要过钠柱，减少金属离子对仪器及色谱柱的损坏，再经离子色谱柱-脉冲安培检测器测定葡萄糖的含量，通过换算系数折算得到酵母β-葡聚糖的含量。

该方法准确可靠，结果重现性良好，回收率高，实用价值高，适用于乳制品中酵母β-葡聚糖的检测。