郭朝刚

甘肃省天水市麦积区畜牧兽医事务服务中心，甘肃天水 741020

0 引言

乳房炎是奶牛较为常见疾病之一。全球将近40%奶牛患有乳房炎，而我国的发病率更接近70%，是一种发病率高且较难预防和治疗的疾病。奶牛患有乳房炎后，会影响乳腺的泌乳功能，导致产奶量降低，乳质量降低[1]，如不及时治疗，还会引发奶牛全身系统疾病，增加治疗周期和治疗成本，给牧场造成更多的经济损失[2]。引起奶牛乳房炎以大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌最为常见，占90%以上。其中大肠杆菌分离率高，入侵奶牛乳房后能迅速产生内毒素，且具极强的耐药性，为乳房炎治疗带来很大挑战[3]。

甘肃是农业大省，奶牛养殖业是重要的农业产业。甘肃的奶牛养殖业主要集中在兰州、天水、平凉、陇南等地，经过常年的发展，正在逐渐改变以往传统的养殖方式，更加注重科学、规范和高效，但奶牛乳房炎仍是困扰发展的难题，发病率在25%以上[4]。本研究采集甘肃天水3 个奶牛场患有临床乳房炎奶牛乳样，进行病原菌的分离鉴定及药敏试验，为当地防控乳房炎提供参考。

1 试验材料

1.1 试验动物

2022年10—12月选取甘肃天水3 个规模化奶牛场40 头患有临床乳房炎的奶牛作为研究对象，奶牛具体表现为对乳区触碰反应敏感，乳房红肿、发热及乳汁中有血丝和凝块现象。共120 份奶牛乳房炎乳样，每头牛各乳区的乳样均作为独立样本，不可混采。

1.2 主要试剂及仪器

CAMHBT营养肉汤、MH培养基、甘露醇氯化钠培养基、水解酪蛋白肉汤培养基、麦康凯培养基、SS培养基、血琼脂平板、革兰氏染液、LB肉汤培养基、革兰氏阴性菌鉴定板、革兰氏阴性菌药敏板，美国赛默飞公司；恩诺沙星、氨苄西林、阿莫西林、头孢唑啉、氧氟沙星、头孢噻呋、庆大霉素、环丙沙星、阿奇霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、多西环素、土霉素、头孢氨苄、四环素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺异唑等抗菌药物标准品，中国兽医药品监察所。

梅里埃全自动细菌鉴定仪、恒温培养箱、高温灭菌锅，嘉兴中新医疗仪器有限公司；超净台，美国赛默飞公司。

2 试验方法

2.1 样品采集

对奶牛乳区消毒后，弃去头3 把奶，每个乳区收集10 mL乳样，置于无菌离心管中于4 ℃保温盒中，送至中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所实验室进行病原菌的分离鉴定。

2.2 病原菌的分离和鉴定

采集2 mL乳样分别涂抹接种在甘露醇氯化钠培养基、血琼脂平板、麦康凯培养基、SS培养基中，置37 ℃恒温箱中培养24 h后，选择有特定颜色、形状、光泽的菌落。其中，甘露醇氯化钠培养基中选择金黄色、圆形菌落；血琼脂平板中选择具有溶血环、圆形、暗金属光泽的小菌落；麦康凯培养基中选取圆形、红色金属光泽菌落；SS培养基中选取圆形、黑色金属光泽菌落。

将4 种培养基中选取的菌落用平板划线法增殖培养，纯化后进行将菌液加入梅里埃全自动细菌鉴定仪中进行细菌鉴定[5]。

2.3 体外药物敏感试验

2.3.1 菌液制备

使用接种环在LB肉汤培养基中挑选复活的大肠杆菌样本，并在37 ℃环境中进行6～8 h复苏培养。为确保单菌落活性，在血琼脂平板上继续进行37 ℃的6～8 h培养。经过镜检后，使用无菌棉签将菌落提取并置入水解酪蛋白肉汤培养基中进行稀释，使其达到1.5×108CFU/mL，储存备用。

2.3.2 药敏试验

采用Kirby-Bauer纸片扩散法对大肠杆菌进行药敏试验[6]。从高压灭菌的棉签中获取菌液浓度为1.5×108CFU/mL的大肠杆菌菌液。在经过灭菌的空心管中通过挤压去除多余菌液，然后轻轻涂抹到MH培养基的表面上。将平皿置于超纯工作台中静止2～3 min，使表面菌液变干。用经过灭菌的镊子将药敏纸片轻轻压实到平皿表面上。每个平皿上放置5 种不同药敏纸片，每个菌株3 个平行样本。将平皿置于37 ℃培养箱内培养18～24 h。最后用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录结果。按照美国临床试验标准，大肠杆菌对各种药物的耐药性及敏感性都根据纸片抑菌圈直径判定，标准如表1所示，分别有耐药、中介和敏感3 个等级。此外，药敏试验出现耐药或中介2 个等级均可判断大肠杆菌耐药。

表2 乳房炎病原菌分离、鉴定结果

3 试验结果

3.1 病原菌分离、鉴定结果

成功分离出140 个菌株，9 种不同的病原菌（表2）。大肠杆菌45 株，产气肠杆菌2 株，金黄色葡萄球菌38 株，表皮葡萄球菌8 株，腐生葡萄球菌4 株，无乳链球菌20 株，乳房链球菌12 株，停乳链球菌10株、沙门氏菌1 株。其中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的数量最多，分别占32.1%、27.1%和14.3%。

3.2 大肠杆菌药敏试验结果

通过Kirby-Bauer纸片扩散法测定不同抗菌药物对大肠杆菌的影响程度（表3）。45 株大肠杆菌受试菌株中有45 株对青霉素耐药，耐药率高达100%，而大肠杆菌对万古霉素的敏感性最高，45株菌株中未检测到耐药性。此外，氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素对大肠杆菌敏感率均为95.6%；卡那霉素对大肠杆菌敏感率为86.7%；氨苄西林和四环素对大肠杆菌敏感率为55.6%；红霉素对大肠杆菌敏感率为44.4%。

表3 大肠杆菌药敏试验结果

4 分析与讨论

4.1 奶牛乳房炎病原菌分离鉴定

奶牛乳房炎一般为多种病原菌混合感染导致，常见主要有20 多种。病原菌分离常见的有培养基分离法、抗生素敏感法及菌落膜法，其中培养基分离法和抗生素敏感法较常用。

本试验采用培养基分离法。其基于生物学培养原理，即每种病原菌在不同培养基中生长情况不同，具有特定颜色、形状、光泽，因此通过对不同培养基中菌落进行选择可分离出不同菌株，该方法易实现，不需复杂技术，且通过对不同培养基进行分离可获得较多菌株，从而提高分离效率。但需指出的是，该方法不能保证分离出所有病原菌，会有遗漏，且对病原菌判定只基于菌落外观特征，而不是通过其生物学特性或基因组等信息，因此还需进一步鉴定。

对病原菌进行鉴定的方法有生化反应鉴定、染色鉴定、生物学鉴定等。染色鉴定通常使用各种染色液，对分离出的病原菌进行染色，观察菌丝形状、颜色、结构等特征以确定病原菌种类，这种方法简便易行，不需高技术人员，但染色效果不稳定，容易出现误诊。生物学鉴定通常使用生物学试剂盒，对分离出的病原菌进行生物学试验，如酶活性试验、吸纳试验等，以确定病原菌种类，这种方法鉴定结果准确，但复杂、耗时。本试验使用生化反应鉴定，即使用梅里埃全自动细菌鉴定仪，对分离出的病原菌进行生化反应，如代谢特征、酶特征、吸纳特征等，以确定病原菌种类，这种方法简便、快速，鉴定结果准确。

据研究，不同地区引起奶牛乳房炎的病原菌种类及比例都有区别。新疆地区大肠杆菌的检出率最高，占20.9%，而无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的检出率分别为14.6%和14.5%；吉林地区大肠杆菌的检出率最高，为34.5%，其次为无乳链球菌和金黄色葡萄球菌，检出率分别为23.0%和11.8%[7]。各地区结果不一致的主要原因是地理环境、气候不同，而同一地区奶牛场由于卫生环境、饲养技术、管理规范制度不同也可能导致病原菌种类出现差异。

4.2 大肠杆菌药敏试验

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌之一，给奶牛养殖业造成很大经济损失。目前针对奶牛乳房炎的临床用药主要有：青霉素类、四环素类、头孢菌素类以及磺胺类。近年由于缺乏合理用药意识，盲目使用及随意加大剂量使用，导致耐药菌越来越多，耐药谱越来越宽，为临床中奶牛乳房炎治疗增添更多困难。研究报道，在新疆地区奶牛乳房炎中大肠杆菌对青霉素和红霉素的耐药率较高，分别为95.2%和90.5%，使这两种药几乎无效；辽宁地区奶牛中大肠杆菌对青霉素严重耐药，耐药率高达99.2%，对红霉素、四环素和氨苄西林的耐药率相对较高，在47%～90%[8]。综上研究可发现，由于日常用药习惯，不论什么地区，常用药物如青霉素，红霉素，四环素的效果越来越差。本试验耐药性结果与其他地区结果相接近，大肠杆菌对青霉素耐药率较高；四环素、红霉素和氨苄西林的耐药率在22.2%左右，而万古霉素的耐药性几乎没有。分析原因是青霉素、红霉素、四环素知名度高且相对便宜，各大奶牛场都选择这类药物进行乳房炎治疗，而万古霉素一方面是成本更高，另外虽然抗菌谱更广，可治疗更多种细菌感染，但副作用相对更严重，因此实际应用中会更谨慎选择万古霉素和卡那霉素治疗常见奶牛乳房炎疾病。

最后应当指出的是，不同地区奶牛场的奶牛，对不同抗菌药物的耐药性差别影响到实际药物疗效。Kirby-Bauer纸片扩散法主要测定大肠杆菌等细菌的耐药性，其原理是在特定培养基上涂抹大肠杆菌样本，再在上面放置抗生素纸片，最后观察细菌生长情况，以此判断细菌对抗生素的耐药性。该方法简单易行无需复杂设备，成本较低且能快速准确测定大肠杆菌的耐药性，适合各大奶牛场在选择药物前进行简单的药敏试验诊断，并根据结果选择最合适的抗菌药物，制定合理用药方案。