◎ 杨军丽，冯所兰，刘 真，王玉梅

（南京市食品药品监督检验院，江苏 南京 211198）

酸性橙Ⅱ号是一种色泽鲜艳、着色性强的水溶性化工染料，为了吸引顾客，增大销量，部分不法商贩会将其用作食品中的着色剂和添色剂。酸性橙Ⅱ号属于工业染料，一旦食用后，就会对人体健康产生严重影响，我国卫生部在2008年已经明令禁止其在食品加工中使用[1]。本实验室按照SN/T 3536—2013 中的方法，评定了酱卤肉中酸性橙Ⅱ号残留量的不确定度。不确定度是对检测结果好坏与否的一个重要评判指标[2-5]。本文参照《测量不确定评定与表示》（JJF 1059.1—2012）、《化学分析中的不确定度的评估指南》[6]，测量并评定其不确定度，可确保检测过程和结果的可靠性。

1 仪器与材料

1.1 试验仪器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪；赛多利斯CPA225D 电子天平；色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6 μm×250 mm）。

1.2 材料与试剂

酸性橙Ⅱ号 (曼哈格，100 mg，98.3%)；玻璃量器经检定均为A 级；甲醇、乙酸铵及甲酸均为色谱纯级；乙醇及氨水均为分析纯级。

2 试验与方法

2.1 样品处理

酱卤肉来自食品安全监督抽检空白基质样品，称取2 g 加入400 μL 的标准酸性橙Ⅱ 号标准溶液（0.988 0 μg/mL），理论加标浓度为 0.2 mg/kg。 将其充分涡旋震荡 5 min、超声 5 min 混匀后，作为检测样品。

首先，准确称取制备好的均匀样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，向其中加入20 mL 乙醇-氨水溶液，超声波提取30 min，再振荡提取10 min 后，以80 000 r/min 将其离心10 min，将试样再重复提取一次后，合并提取液，将提取液浓缩至约10 mL，混匀后待净化。接着，依次用3 mL 甲酸水溶液和3 mL甲醇溶液淋洗固相萃取柱，再将待净化液转移至固相萃取柱中，用氨水甲醇混合溶液6 mL洗脱固相萃取柱。最后，将洗脱液收集后进行氮吹至近干，向试管中准确加入2 mL超纯水涡旋均匀，过滤后供液相色谱检测。

2.2 色谱条件

色谱条件：流动相；甲醇∶20 mmol/L 乙酸铵=65 ∶35；色谱柱：Agilent Eclipse C18 150 mm×4.6 mm，粒径为5 μm；检测波长：484 nm；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温为室温即可。

2.3 检测方法

标准溶液的配制：准确称取10.05 mg 酸性橙II 号标准品（纯度＞95%），用水稀释并定容至10 mL 容量瓶中，配成浓度为0.988 0 mg/mL 的标准储备，4 ℃贮藏备用。采用外标法用水稀释标准溶液，并配制成所需的标准工作曲线。

2.4 建立数学模型

测量不确定度数学模型如下所示：

式中，X为试样中酸性橙II 号的含量，mg/kg；C为试样中酸性橙Ⅱ号的浓度，μg/mL；V为试样最终的定容体积，mL；m为称取试样的质量，g。

3 酸性橙Ⅱ号测定不确定度来源分析

3.1 总体分析

本文基于高效液相色谱法测定食品中酸性橙Ⅱ号残留量的不确定度，主要来自以下几个方面：标准溶液的配制及标准工作液的稀释误差、标准溶液配制过程中的器具刻线误差、实验室环境温度的变化、样品的称量误差、样品的定容体积误差、重复性的测定等。

3.2 标准溶液及其配置过程中引入的相对标准不确定度

3.2.1 标准溶液引入的相对不确定度urel(C1）

标准溶液引入的相对不确定度urel(C1），由标准物质纯度、标准物质称量过程及稀释定容过程3 个不确定度分量组成。

（1） 标准物质纯度误差引入的不确定度urel（P1）

通过查阅其标准物质证书可知，其纯度误差是± 2.0%，参照均匀分布，，计算相对不确定度为：

（2）标准物质称量误差引入的不确定度urel(M1）

标准品称量：称取酸性橙II 号标准品质量为10.05 mg，使用天平的精度为0.01 mg，按照均匀分布。称量重复性影响甚微，所以由其引入的不确定度不予考虑。由标准品称量导致的相对标准不确定度为：

（3）标准物质定容误差的不确定度urel(V1）

标准溶液的配制：查得10 mL 单线容量瓶的允差规定为± 0.020 mL，根据矩形分布评定其相对标准不确定度为：

标准溶液所引入的不确定度：

3.2.2 标准溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel(C0）

用1.0 mL 移液管移取酸性橙II 号标准储备液1.0 mL，置于洁净100 mL 容量瓶中，水定容、混匀，浓度为0.988 0 mg/L。按照标配配置标准溶液，酸性橙II 的标准色谱图详见图1。依据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，采用容量允差法评定不确定度，分析稀释标准溶液引入的不确定度。

图1 酸性橙Ⅱ号的标准色谱图

（1）玻璃量器引入的相对标准不确定度urel(V）

经查1.0 mL 移液管校准容量允差是± 0.007 mL，参照均匀分布，计算相对标准不确定度为：

查得100 mL 容量瓶校准容量允差是± 0.01 mL，参照均匀分布，计算相对标准不确定度为：

（2）环境温度变化引入的不确定度urel(T）

得到酸性橙Ⅱ号标准溶液配制引入的相对不确定度为：

3.3 样品制备引入的不确定度

试样制备是将样品经充分混匀后称量，因此，样品具备很好的均匀性，可以忽略取样所产生的不确定度。

3.3.1 样品的称量引入的相对不确定度urel(M）

称取2 g 样品，使用的电子天平查得其最大允许误差是0.01 g， 参照均匀分布，。得到称量带入的相对不确定度为：

3.3.2 样品最终定容体积的相对标准不确定度urel(V）

2.0 mL 移液管容量允差为±0.012 mL，按三角分布，则2.0 mL 移液管相对不确定度为：

得到环境温度变化引起的相对不确定度为：

试样最终定容体积引入的相对不确定度为：

3.3.3 测量重复性引起的相对标准不确定度urel(Y）

本研究依据标准方法，对酱卤肉样品进行6 次重复测量，计算平均值及标准偏差，得出由测量重复性带入的相对标准不确定度，测量结果和标准偏差的相对不确定度计算结果见表 1 。

表1 平行测量酸性橙II 带入的相对标准不确定度表(n=6)

3.4 试剂空白

本实验所用试剂均符合标准规定的要求，由于空白所产生的的影响很小，可忽略不计 。

3.5 合成不确定度

综合上述所有关于不确定度的分析，样品中酸性橙Ⅱ号的测定结果相对标准不确定度为详见表2。

表2 酸性橙Ⅱ号测定的相对标准不确定度表

3.6 扩展不确定度urel（X）

取扩展因子K=2，在95%置信水平下，相对扩展不确定度为：urel(X) =K·urel(X) = 2 . 5 6 ×10-2。

3.7 测量结果

实验数据中，称样量为2.000 1 g 样品中酸性橙Ⅱ号含量为0.173 mg/kg，则其扩展不确定度为：U=ure（l(x）×0.173=0.00443 mg/kg。酸性橙Ⅱ号的测定结果表示为：(0.173±0.004 43) mg/kg。

4 结论

本实验采用液相色谱法对酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ号含量进行了测定，由分析结果可知，标准物质的纯度对结果的影响较大，而试样的定容、称量以及仪器进样重复性，对结果的影响相对较低。因此，在今后的检测工作中，检测人员对于这种非法添加的物质，需时刻保持数据敏锐性，在检测过程中，应当选用符合标准纯度要求的标准品和玻璃器皿。同时，检测人员要提高自身技术水平，开展测试前应该仔细研读标准文书，把握好实验操作中的各个关键控制点。例如，通过自行加标、内部质控样、留样待测等多种方式来确保回收率，以保证数据准确可靠。必要时，测试人员还可以对实验结果进行不确定度评价，做到心中有数，不错判、不误判，为食品行业的健康发展以及守护人民群众“舌尖上的安全”，贡献一份绵薄之力。