杨一秋 解继胜

(右江民族医学院 1研究生学院,广西 百色 533000;2基础医学院组织胚胎学教研室)

骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构退化,骨骼脆性增加的疾病〔1〕,常好发于女性,尤其是50岁以上的女性。骨质流失是一个无声的过程,没有疾病的体征和症状。可能导致骨折、骨活动能力改变及功能下降,最终严重影响患者的生活质量〔2,3〕。通过双能X线骨密度测定法(DEXA)测定骨密度,是诊断骨质疏松的“金标准”。1999年颁布的DVO指南中提供了诊断和治疗绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松和糖皮质激素诱发的骨质疏松的策略,指南中提到通过补充钙和维生素D及双磷酸盐如阿仑磷酸盐等来治疗骨质疏松〔4〕,但是由于存在子宫内膜癌、乳腺癌、血栓栓塞性等多种副作用,目前还没有安全有效的药物来治疗骨质疏松,提前预防才是解决问题的最佳方法。MiRNA是小的非编码RNA,通过识别同源序列,干扰转录、翻译或表观遗传过程来调节基因表达。MiRNA被Drosha酶剪切成初级miRNA(pri-miRNA)再进一步加工成前体miRNA(pre-miRNA),最后通过Dicer酶加工生成成熟miRNA〔5〕。多项研究表明miRNA在骨质疏松发生发展过程中发挥重要作用〔6～9〕。生物信息学及基因芯片分析技术已经广泛应用于筛查基因组、转录组等水平的变化。本研究拟通过生物信息学方法筛选出骨质疏松中差异表达的miRNA,并查找分析关键靶基因的功能和作用,以期为骨质疏松的诊断及发病机制提供依据。

1 材料和方法

1.1芯片信息 从GEO数据库获得骨质疏松与非骨质疏松基因芯片表达谱,两个数据集分别是GSE91033和GSE74209,其中GSE91033包括1例正常对照组和2例骨质疏松患者的血清miRNA表达谱。GSE74209包括6例正常对照组和6例骨质疏松患者髋骨组织miRNA表达谱。

1.2筛选两个数据集中差异miRNA 使用GEO数据库中GEO2R在线分析工具,按调整后P<0.05,logFC>1或logFC<-1分别筛选两个数据集中差异miRNA并通过SangerBox工具绘制差异miRNA火山图。

1.3选取两个数据集中均上调miRNA 使用TBtools软件绘制GSE91033和GSE74209两个数据集中均上调miRNA的韦恩图。

1.4差异miRNA的靶基因预测 通过TargetScan在线预测两个数据集中均上调miRNA的靶基因并通过FunRich软件、DAVID在线数据库对靶基因做GO、KEGG功能富集分析和转录因子预测。

1.5靶基因调控网络图 通过STRING在线工具绘制靶基因调控网络图,筛选条件为最高可信性(highest confidence)>0.9,然后通过Cytoscape软件中的cytohubba插件按照Degree算法筛选出前20的基因。

1.6统计学分析 采用Wilcoxon检验分析。

2 结 果

2.1差异miRNA的筛选 通过分析这两个数据集中差异miRNA的表达,结果显示在GSE91033数据集中,与正常组对比,骨质疏松组外周血中差异miRNA有204个。其中有164个miRNA上调,40个miRNA下调。在GSE74209数据集中,与非骨折组相比,骨折组中有138个差异miRNA,其中有39个miRNA上调,99个miRNA下调。见图1。

黑点为正常样本与骨质疏松患者样本中没有差异表达的miRNA,红点和绿点分别为骨质疏松患者样本中上调和下调的miRNA图1 两个数据集中差异miRNA的火山图

2.2两个数据集中均上调miRNA的选取 分别将两个数据集中上调和下调的miRNA做韦恩图,发现两个数据集中均上调的miRNA共有6个(分别为hsa-miR-3148、hsa-miR-4514、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-2467-3p、hsa-miR-1299、hsa-miR-5096)。两个数据集中均下调的miRNA只有1个,数量太少不符合分析条件,故而选取在两个数据集中均上调的miRNA作为研究对象。

2.3GO、KEGG功能富集分析与转录因子预测 通过TargetScan在线数据库预测6个均上调的miRNA的靶基因,结果表明这些miRNA的靶基因共有353个,它们的GO生物过程包括三酰甘油合成过程、细胞分裂、细胞对DNA损伤刺激的反应、成纤维细胞迁徙的正向调控、骨重建等。KEGG富集分析得到缺氧诱导因子(HIF)-1信号通路、细胞外基质(ECM)受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、E-钙黏蛋白(cadherin)信号通路等。通过FunRich软件对靶基因的转录因子进行预测,根据其所调控的基因数与P值,选取富集程度最显著的10个转录因子进行展示,包括:锌指蛋白(ZFP)161、叉头框蛋白(FOX)A1、肝细胞核因子(HNF)1A、胚胎干细胞基因(POU5F)1、同源盒基因(LHX)4、DBX1、NKX6-1、RORA、TCF3、FOX12。见表1、图2。

表1 靶基因的KEGG富集分析

图2 靶基因的GO富集分析

2.3构建靶基因网络调控图和Hub基因分析 通过STRING绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI),得到351个节点,116条边。通过Cytohubba插件分析得到20个节点,其中处于枢纽地位的基因有3个,分别是丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、着丝粒相关蛋白(DSN)1、UBE203。见图3。

图3 靶基因蛋白网络调控图及枢纽基因查找

3 讨 论

本研究说明,hsa-miR-3148、hsa-miR-4514、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-2467-3p、hsa-miR-1299、hsa-miR-5096有可能参与了骨质疏松机制,有作为骨质疏松潜在分子诊断标志物的可能,同时,本研究预测并筛选出关键基因MAPK1、DSN1、UBE203。Yu等〔10〕通过GEO数据库分析骨质疏松患者和健康个体中差异表达的基因有TP53、MAPK1、CASP3、CTNNB1、NOTCH1、CDK1等,并通过体内外实验验证在PPI中得分最高的P53基因,在骨质疏松患者和小鼠骨质疏松模型中均上调,这些发现表明P53可能在骨质疏松的发展中发挥核心作用。

骨骼是一个代谢非常活跃的器官,在整个生命过程中都会经历不断的重塑。骨重塑包括破骨细胞消化去除矿化骨,然后通过成骨细胞形成骨基质并矿化成骨细胞。骨重建有助于修复骨基质中的微损伤,防止旧骨的积累,通过调整骨结构以满足不断变化的机械需求〔11〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α是缺氧反应的主要调节因子之一,在骨骼建模、重塑和体内平衡中起着重要作用。既往研究结果表明,HIF-1α通过激活MLO-Y2细胞中的Janus 激酶(JAK)3 / 信号转导和转录激活因子(STAT)4通路来促进破骨细胞分化因子(RANKL)的表达,并在体外增强骨细胞介导的破骨细胞分化〔12〕。骨细胞是骨骼中数量最大、寿命最长的细胞类型,机械刺激可以诱导和调节各种细胞功能,如基因表达、蛋白质合成及细胞增殖和分化等。在骨组织中,骨细胞被认为是对机械刺激有反应的主要细胞类型,体内和体外研究表明骨细胞骨架、树突状突起、以整合素为基础的局灶粘连、连接素为基础的细胞间连接、初级纤毛、离子通道和细胞外基质是目前报道的骨细胞中主要的机械传感器〔13〕。Perlecan是一种硫酸乙酰肝素多糖,可作为骨骼的机械传感器,Perlecan缺乏会损害钙信号传导加上ECM-受体相互作用和黏着斑通路的改变,可能导致缺乏Perlecan小鼠的成骨减少和增加Schwartz-Jampel综合征患者患骨质疏松的风险〔14〕。本研究靶基因预测到的转录因子有POU5F1、ZFP161、FOXA1、HNF1A、LHX4、DBX1、NKX6-1、RORA、TCF3、FOXJ2等。Su等〔15〕研究发现,白藜芦醇是一种具有雌激素活性的天然化合物,对骨骼具有保护作用并在体内外模型中起到降低患乳腺癌的风险。Forkhead蛋白对于白藜芦醇的这两种作用必不可少,骨保护作用归因于通过src激酶依赖性雌激素受体激活诱导骨形态发生蛋白2,而FOXA1是白藜芦醇诱导的雌激素受体依赖性骨形态发生蛋白2的表达所必需的。

综上,筛选出来的差异miRNA有可能作为骨质疏松潜在的生物标志物,有助于骨质疏松治疗药物的研究和开发,靶基因的识别为骨质疏松的诊断和治疗提供了新的方向。C57BL/6雌性小鼠通过摘除双侧卵巢可以成功建立动物骨质疏松模型〔16〕,为本研究下一步体内体外验证实验提供了重要的参考依据。