孙树刚 刘英琪 施 喆 周丽媛 杨 勇 王晓辉

1.河北工程大学附属医院普外科 (河北 邯郸, 056000) 2.河北工程大学附属医院妇科

肝癌是全球常见的严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势。姜黄素是一种从姜科植物的根茎中提取的天然酚类色素,具有广泛的抗肿瘤作用[1-3]。研究表明,姜黄素可抑制肝癌细胞迁移和侵袭[4]。过氧化物氧化还原蛋白 6(Prdx6)是Prdx家族的一员,同时具有磷脂酶A2和过氧化物酶双重活性,有研究报道Prdx6在肝癌患者癌组织中高表达,且表达水平与患者不良预后显著相关[5]。另有研究发现,Prdx6过表达能够促进肝癌细胞增殖活性、增强其迁移和侵袭能力[6]。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞在特定情况下向间质细胞分化的现象,在恶性肿瘤细胞的迁移和侵袭中起重要作用。上皮细胞标志物E-cad的丧失以及间质细胞标志物N-cad和Vimentin的升高是肝癌细胞发生远处侵袭和转移的象征[7]。本研究以肝癌HepG2细胞为对象,探讨姜黄素是否可通过调节Prdx6表达抑制肝癌细胞的恶性生物行为学。

1 材料和方法

1.1 细胞系 人肝癌细胞株HepG2购自美国ATCC公司。

1.2 试剂和仪器 姜黄素和MTT试剂盒购自美国Sigma公司;胎牛血清和培养基购自美国Gibco公司;Matrigel基质胶购自美国BD公司;Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司;Prdx6过表达质粒和空白对照质粒购自上海生工生物工程有限公司;兔抗人神经钙黏蛋白(N-cad)、上皮钙黏蛋白(E-cad)以及波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Abcam公司;倒置显微镜购自日本Olympus公司;酶标仪购自美国MDC公司。

1.3 细胞培养 HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、5% CO2以及饱和湿度的恒温培养箱中,每2 d更换新的培养基,显微镜下观察,待细胞密度达80%以上时进行传代,取第4代对数生长期的细胞进行实验。

1.4 MTT法检测细胞存活率 将细胞制成单细胞悬液,以每孔2×103个细胞的密度接种于96孔板内,待细胞贴壁生长后,参照文献[8]方法,分别用0、10、20、40和60 μmol/L姜黄素处理细胞,每组设置3个复孔。培养箱中继续培养24 h后,每孔加入20 μl MTT溶液,重新置于培养箱中培养4 h,每孔加入DMSO振荡混匀直至紫色结晶完全溶解。置于酶标仪上测定490 nm波长处的吸光度(A)值,计算细胞活力和半数抑制浓度(IC50)。根据IC50确定后续实验中采用40 μmol/L姜黄素处理细胞。

1.5 细胞转染与分组 取第4代对数生长期HepG2细胞,以每孔2×103个细胞的密度接种于96孔板内,待细胞贴壁生长后,将细胞随机分为对照组、姜黄素组、空载体组、Prdx6过表达组以及Prdx6过表达+姜黄素组,每组设置3个复孔。根据Lipofectamine 2000说明书将过表达PIRES-EGFP-Prdx6载体转染Prdx6过表达组和Prdx6过表达+姜黄素组细胞,24 h后,Prdx6过表达+姜黄素组细胞和姜黄素组细胞加入40 μmol/L姜黄素处理24 h;空载体组细胞转染PIRES空载体24 h;对照组细胞不做处理。24 h后,按照1.4的实验方法计算细胞存活率。

1.6 qRT-PCR法检测Prdx6 mRNA相对表达量 24 h后,弃掉培养液,预冷PBS清洗细胞3次,每孔加入1 ml Trizol试剂提取总RNA,测定RNA浓度并将RNA逆转录成cDNA,以cDNA为模板,GAPDH为内参,PCR仪进行扩增,条件设置为：95℃预变性5 min,95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共进行35个循环,以2-ΔΔCT法计算Prdx6 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力 将HepG2细胞按2×103/ml密度接种于24孔板,细胞融合度达80%以上时,100 μl无菌枪头垂直培养板底部均匀划线,预冷PBS清洗3次,置于培养箱中培养24 h,显微镜下观测划痕宽度。细胞划痕愈合率(%)=(0 h细胞划痕宽度-24 h细胞划痕宽度)/0 h细胞划痕宽度×100%。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力 基质胶用无血清培养基稀释(1∶3),将50 μl稀释后的基质胶加入到上室中,将HepG2细胞按2×103/ml密度接种于上室,每孔150 μl。Transwell下室中加含10%胎牛血清的培养基600 μl,将小室置于培养箱中培养24 h,取出小室,湿棉签将未侵袭细胞擦去,多聚甲醛固定小室20 min,并用结晶紫染色15 min,显微镜下观察并计数穿膜细胞数,随机取3～5个视野拍照。

1.9 蛋白印迹法检测细胞中各蛋白相对表达量 收集对数期细胞,裂解液裂解,离心取上清液,BCA试剂盒测定蛋白浓度,调整蛋白浓度,煮沸。120 v恒压电泳,直至溴酚蓝到达凝胶底部,0.3 A恒流湿转2 h,TBST洗膜,室温封闭,E-cad、N-cad和Vimentin抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜,二抗(1∶5 000)室温孵育2 h,TBST洗膜,ECL显色液显影,Image J分析条带灰度值,目的蛋白条带灰度值/GAPDH灰度值为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素对HepG2细胞存活率的影响 不同浓度(0、10、20、40、60 μmol/L)姜黄素处理24 h后,HepG2细胞存活率(%)分别为100.00、82.05±3.55、63.76±4.13、46.70±3.50、33.98±3.28,差异有统计学意义(P<0.05)。与0 μmol/L姜黄素组比较,各浓度姜黄素组细胞存活率降低,且具有浓度依赖性(P<0.05)。经计算,姜黄素对HepG2细胞的IC50为36.87 μmol/L,故后续实验中采用40 μmol/L姜黄素处理细胞。

2.2 姜黄素对HepG2细胞Prdx6 mRNA表达的影响 Prdx6 mRNA相对表达量组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(6.38±1.04)比较,姜黄素组Prdx6 mRNA(1.29±0.08)相对表达量降低(P<0.05);与姜黄素组比较,Prdx6过表达+姜黄素组Prdx6 mRNA(3.87±1.12)相对表达量升高(P<0.05);与空载体组(6.42±1.03)比较,Prdx6过表达组Prdx6 mRNA(8.97±1.10相对表达量升高(P<0.05);与Prdx6过表达组比较,Prdx6过表达+姜黄素组Prdx6 mRNA相对表达量降低(P<0.05)。

2.3 姜黄素和Prdx6表达对HepG2细胞存活率的影响 细胞存活率组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(100.00%)比较,姜黄素组细胞存活率(63.65±4.05)降低(P<0.05);与姜黄素组比较,Prdx6过表达+姜黄素组细胞存活率(81.86±4.01)升高(P<0.05);与Prdx6过表达组(98.79±5.36)比较,Prdx6过表达+姜黄素组细胞存活率降低(P<0.05)。对照组、空载体组(98.21±5.22)以及Prdx6过表达组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 姜黄素和Prdx6表达对HepG2细胞迁移能力的影响 细胞划痕愈合率组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(77.82±4.25)比较,姜黄素组细胞划痕愈合率(47.98±3.46)降低(P<0.05);与姜黄素组比较,Prdx6过表达+姜黄素组细胞划痕愈合率(65.36±4.37)升高(P<0.05);与空载体组(78.55±4.13)比较,Prdx6过表达组细胞划痕愈合率(91.22±5.62)升高(P<0.05);与Prdx6过表达组比较,Prdx6过表达+姜黄素组细胞划痕愈合率降低(P<0.05)。对照组和空载体组细胞划痕愈合率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 细胞划痕实验

2.5 姜黄素和Prdx6表达对HepG2细胞侵袭能力的影响 侵袭细胞数组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(125.58±6.37)比较,姜黄素组侵袭细胞数(57.22±4.28)减少(P<0.05);与姜黄素组比较,Prdx6过表达+姜黄素组侵袭细胞数(94.37±5.72)增多(P<0.05);与空载体组(127.33±6.56)比较,Prdx6过表达组侵袭细胞数增多(P<0.05);与Prdx6过表达组(197.67±6.58)比较,Prdx6过表达+姜黄素组侵袭细胞数减少(P<0.05)。对照组和空载体组侵袭细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 结晶紫染色图

2.6 姜黄素和Prdx6表达对HepG2细胞EMT相关蛋白表达的影响 E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量比较

图3 细胞中各蛋白表达电泳图 (A为对照组,B为姜黄素组,C为空载体组,D为Prdx6过表达组,E为Prdx6过表达+姜黄素组)

3 讨论

肝癌发病机制复杂,具有起病隐匿、进展速度快以及易转移等特点,临床上治疗肝癌的抗癌药物常引起多种不良反应,且长期使用会出现耐药性,因此寻找一种毒副作用小且有效的药物,用于治疗肝癌和提高患者生活质量至关重要[9]。

姜黄素是从姜黄中提取得到的一种植物多酚,具有多种药理学活性,Liang等[10]研究发现,姜黄素通过促进HepG2细胞焦亡和凋亡,诱导HepG2细胞发生死亡,从而在肝癌中发挥抗癌作用。Han等[11]研究发现,姜黄素通过下调DJ-1表达从而抑制肝癌细胞增殖。本研究采用不同浓度姜黄素处理HepG2细胞,结果发现HepG2细胞的存活率随姜黄素浓度的升高而降低,且具有浓度依赖性。结果表明：姜黄素可抑制肝癌细胞增殖。Prdx6是一种广泛存在于各组织器官中的过氧化酶,由224个氨基酸组成,近年来,Prdx6在癌症中的作用受到广泛关注,研究发现,在宫颈癌组织中Prdx6高表达,过表达Prdx6可促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡[12]。研究表明,敲除Prdx6的HepG2细胞分裂减缓、线粒体功能发生障碍,细胞周期阻滞在G2/M期,因此在肝癌中发挥抗癌作用[13]。He等[14]研究发现,食管鳞癌组织中Prdx6表达显著高于正常组织,过表达Prdx6可促进食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭。Huang等[15]研究发现Prdx6在结肠癌中呈阳性表达,沉默HCT-116细胞中Prdx6表达则显著抑制结肠癌细胞迁移和侵袭。基于以上研究,我们猜测姜黄素可能通过抑制Prdx6表达从而在肝癌中发挥抗癌作用。本研究结果显示：HepG2细胞中Prdx6过表达后细胞存活率和划痕愈合率升高,侵袭细胞数增多,给予姜黄素处理后细胞存活率和划痕愈合率降低,侵袭细胞数减少。结果表明姜黄素可拮抗Prdx6的促癌作用。

肿瘤细胞发生迁移和侵袭与上皮间质转化过程密切相关,上皮间质转化是一种具有极性的上皮细胞在某些病理情况下与微环境相互作用向间质细胞转化的现象[16]。E-cad是广泛分布在上皮组织上的一种跨膜糖蛋白,在维持上皮细胞形态和极性,以及上皮细胞结构完整性方面发挥不可或缺的作用,E-cad的表达与肿瘤分化程度和发展转移密切相关,表达降低或缺失导致癌细胞的黏附能力下降,上皮性癌细胞则顺利实现浸润和转移,在肿瘤的发生发展中起抑制作用,是发生上皮间质转化的关键蛋白[17]。Vimentin是一种重要的骨架蛋白,在维持细胞完整性方面具有重要作用,主要表达与间充质,正常上皮组织中不表达或低表达,是间质细胞的标志性蛋白之一。N-cad也是间质细胞的标志性蛋白,表达上调可促进肿瘤细胞的运动和迁移[18]。Cao等[19]研究发现姜黄素逆转IL-6/STAT3介导的上皮间质转化抑制TCE诱导的肝癌发展。本研究结果显示HepG2细胞中Prdx6过表达后N-cad和Vimentin蛋白表达升高,而E-cad蛋白表达降低,给予姜黄素处理后N-cad和Vimentin蛋白表达降低,而E-cad蛋白表达升高。结果表明：姜黄素可抑制Prdx6诱导的上皮间质转化过程。

综上所述,姜黄素可抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭,其可能是通过降低Prdx6表达发挥调控作用,为临床治疗肝癌提供新的思路。