郭 丹 崔大鹏 韩 帅 李紫宣 冯志林 张迎春 连晶晶 刘 博

1.河北北方学院附属第一医院肝胆外科 (河北 张家口, 075000) 2.河北北方学院附属第一医院创伤急救外科 3.河北北方学院附属第一医院麻醉科 4.河北北方学院附属第一医院核医学科 5.河北北方学院附属第一医院病理科

肝内胆管细胞癌(ICC)为临床常见的一种原发性恶性肿瘤,近年来其发病率不断上升,肝硬化、肝炎病毒感染及肝内胆管结石等均是影响其发生的危险因素[1,2]。在临床中,ICC主要采用根治性手术方法进行治疗,但患者术后复发、预后情况较差。糖链抗原19-9(CA19-9)表面的糖蛋白能够传递信息,当正常细胞出现恶变时其水平较高[3],在临床中已被作为肿瘤诊断、评估的重要标志物,但关于其对肿瘤患者预后的预测价值存在较多争议[4,5]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC-1)为肝素结合生长因子共受体,附着于细胞膜表面,在多种肿瘤中均呈阳性表达,可影响肿瘤细胞的转移及生长[6]。本研究分析GPC-1、CA19-9在ICC组织中的表达并探究其与患者临床病理、预后的关系,为改善患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年7月至2018年12月本院收治的108例ICC患者手术切除的癌组织及癌旁组织蜡块,均经病理科证实。108例患者中男67例,女41例;年龄42～75岁,平均(59.33±7.40)岁;TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期55例,Ⅲ～Ⅳ期53例;肿瘤直径2～6 cm,平均(4.32±1.17)cm;中低分化41例,高分化67例。纳入标准：①所有患者均行根治性手术治疗;②经病理学检测均确诊为ICC患者;③所有患者病例资料详细完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者;②存在严重肾功能疾病者;③为复发肿瘤者;④术前进行放化疗或有远处转移的患者。本研究经伦理委员会批准(批号：2014-0602)。

1.2 试剂与仪器 GPC-1单克隆抗体(货号：CSB-PA009703LA01HU)购置武汉华美生物工程有限公司;CA19-9抗体(货号：FNab10532)购置武汉菲恩生物科技有限公司;山羊抗兔IgG抗体(货号：GtxRb-003-E3EUR)购置武汉艾美捷科技有限公司;二氨基联苯胺(DAB)酶底物显色试剂盒购置福州迈新生物公司;石蜡切片机RM 2016、石蜡包埋机EG1150H均购置德国Leica;光学显微镜BX 45购置日本Olympus。

1.3 免疫组织化学法检测GPC-1、CA19-9表达情况 将从病理科收集的石蜡包埋组织制成厚度为4 μm的切片,依次进行常规二甲苯脱蜡,乙醇、蒸馏水水化,枸橼酸盐缓冲液修复抗原,PBS冲洗后加入体积分数为3%的过氧化氢去离子水阻断内源性过氧化物酶反应10 min,加入一抗并在4℃下孵育过夜,PBS冲洗后加入二抗室温孵育30 min,DAB显色,苏木素复染,脱水、封片。PBS代替一抗作为阴性对照。上述操作严格按照试剂盒说明书进行。在高倍镜(×400)下随机选取3个视野观察,结果判定采用两级标准计分法,染色强度评分：无染色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计0分、1分、2分、3分。阳性细胞占比<26%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。将上述两项评分结果相乘进行判定：<3分为阴性,≥3分为阳性[7]。由2位高年资医师进行双盲法阅片。

1.4 随访 患者术后每6个月随访1次,随访开始时间为手术结束后,直至患者死亡或2021年12月,记录随访期间复发、转移等情况,以死亡为终点事件。

1.5 统计学方法 使用SPSS 20.0软件进行统计分析,计数资料采用n(%)描述,行χ2检验。癌组织及癌旁组织GPC-1、CA19-9表达比较采用配对卡方检验。Spearman法分析癌组织中GPC-1和CA19-9表达的相关性;Kaplan-Meier曲线分析GPC-1及CA19-9表达与患者预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中GPC-1、CA19-9表达情况 ICC癌组织GPC-1及CA19-9阳性表达率分别为70.37%(76/108)、75.00%(81/108),均明显高于癌旁组织9.26%(10/108)、17.59%(19/108)(χ2=84.159,P<0.001;χ2=71.578,P<0.001)。

2.2 癌组织中GPC-1、CA19-9表达相关性分析 见表1。

2.3 GPC-1、CA19-9表达与ICC病理特征关系 见表2。

表2 GPC-1、CA19-9表达与ICC临床病理特征的关系 (n,%)

2.4 GPC-1、CA19-9表达与ICC患者预后的关系 ICC患者总生存率为44.44%(48/108),GPC-1阳性表达患者生存率为28.95%(22/76),阴性表达患者生存率为81.25%(26/32)(Log RanK=21.768,P<0.001);CA19-9阳性表达患者生存率为34.57%(28/81),阴性表达患者生存率为74.07%(20/27)(Log RanK=12.796,P<0.001),见图1。ICC患者复发率为56.48%(61/108),GPC-1阳性表达患者复发率为72.37%(55/76),阴性表达患者复发率为18.75%(6/32)(Log RanK=24.087,P<0.001);CA19-9阳性表达患者复发率为66.67%(54/81),阴性表达患者复发率为25.93%(7/27)(Log RanK=11.870,P=0.001),见图2。

图1 不同GPC-1、CA19-9表达ICC患者生存曲线

图2 不同GPC-1、CA19-9表达ICC患者复发情况分析

3 讨论

GPC-1为硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族中的一员,是由糖、蛋白质和脂质等组成的复杂复合物,可附着于细胞膜表面[8]。国外研究显示,GPC-1丝氨酸残基与硫酸乙酰肝素链相连,然后由硫酸乙酰肝素链通过与各种细胞因子结合而发挥其对细胞的调控作用[9,10]。倪文等[11]、陆飞等[12]研究显示,GPC-1作为细胞膜共受体,正常机体中无表达或表达量非常低,在多种肿瘤细胞中呈阳性表达,在癌变过程中起着关键作用,且与肿瘤的转移及增殖有关。Duan等[13]研究指出,GPC-1可作为预测胰腺癌生存期的重要因素。但是还有学者研究认为,GPC-1在不同肿瘤类型中表达的差异很大,其在胰腺癌、乳腺癌以及肝癌等肿瘤中呈现异常高表达,而在肺癌、子宫内膜癌等肿瘤中表达量很低,认为其在不同肿瘤类型中的作用可能是不同的[14,15]。本研究结果显示,ICC癌组织中GPC-1阳性表达率明显高于癌旁组织,且GPC-1表达与ICC患者肿瘤大小、包膜浸润、淋巴结转移、TNM分期及分化程度有关,但与年龄、性别、肝硬化等无关,提示其可能与ICC的发生有关。通过对患者预后情况分析发现,GPC-1阳性表达患者生存率显著低于阴性表达患者生存率,复发率高于阴性表达患者,因此,临床应用时应对GPC-1阳性表达患者实施针对性干预,以缓解其预后。

CA19-9属于低聚糖蛋白,是由胆道导管细胞、胰腺细胞等产生的连体Lewis血型抗原蛋白,在机体健康状态下CA19-9仅有少量存在,当机体细胞出现癌变时将会有大量CA19-9释放,造成机体CA19-9异常升高[16]。有学者认为,CA19-9在胰腺及胆管等消化道肿瘤中的水平明显升高,为临床诊断消化道肿瘤的常用血清肿瘤标志物[17,18]。吴慧娟等[18]研究显示,CA19-9对ICC具有较高的诊断价值。但是关于CA19-9在ICC组织中的表达情况与患者生存期的关系目前尚未见报告,因此本研究通过检测ICC患者组织中CA19-9表达情况发现,与癌旁组织相比,ICC癌组织中CA19-9阳性表达率明显升高,并且其表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移及分化程度有关,提示CA19-9可能与ICC的发生有关;其中淋巴结转移是ICC的主要转移方式,而TNM分期是评估ICC疾病严重程度的关键,此结果更加说明CA19-9异常表达对ICC疾病的发生、发展及预后具有极大的影响。本研究发现,CA19-9阳性表达患者生存率显著低于阴性表达患者生存率,复发率高于阴性表达患者,进一步提示CA19-9表达异常可影响患者预后。本研究还发现癌组织中GPC-1与CA19-9存在显著正相关性,表明GPC-1与CA19-9共同参与ICC的发生,影响ICC患者病情及预后。