薛思雅,张润峰,王清,陈山*

1(广西大学 轻工与食品工程学院,广西 南宁,530000) 2(信阳农林学院 食品学院,河南 信阳,464000)

1960年,百里香精油(thyme essential oil, TEO)具有抗菌特性已被报道[1]。由于TEO中含有百里酚和香芹酚[2]等酚类活性物质,使其具有广谱的抑菌活性,从而被广泛应用于制药、化妆品、农业和食品工业等领域[3-4]。然而,由于精油(essential oils, EOs)的水溶性较低、挥发性较高、伴随风味因素的影响且具有高浓度潜在毒性[5],使其在食品工业中的应用受到限制。通过将EOs乳化以增强其分散性并防止EOs降解成为一种替代方案[6]。

乳液根据液滴大小可分为粗乳液、微乳液和纳米乳液(nanoemulsions, NEs)[7],其中NEs是指平均粒径在10～100 nm的均匀分散系统,是有前景且可行的封装EOs方法[8]。GUO等[9]研究表明,百里香精油纳米乳液(thyme essential oil nanoemulsion, TEON)具有很强的抗菌作用,其研究重点偏向于超声和乳液协同抗菌,通过研究探索抑菌机制来判断抑菌效果[9-11],然而,NEs液滴大小对抗菌性影响的相关研究仍不够深入,大多都是探索微米和纳米级别EOs的抗菌性能的差异[3]。

NEs具有动力学稳定的优势,不受温度和pH在内的物理和化学变化的影响,更适用于各类研究及应用[12],而且NEs对细菌的抑菌效果是纯EOs的10倍[9]。已有研究表明,相比于TEO,TEON不易降解,稳定性得到提升,具有更高的活性成分负载能力[13],能够极大提升其抗菌活性[14]。NEs可以通过高能量或低能量的方法制备得到[15],其中超声波法作为一种空化辅助技术,具有安全、健康和对环境无害的优点[16],同时也能避免NEs在制备过程中的质量损耗并保证其化学成分不受影响[15],已成为一种很有前景的方法。因此,本文选取了环境卫生和食品卫生学中典型的4种细菌,在探索了不同TEO浓度下制备的TEON对抑菌性影响的基础上,再探索其粒径大小对不同菌株抑菌性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠,天津北辰方正试剂厂;无水磷酸氢二钠,天津大茂化学试剂厂;磷酸二氢钾,国药集团化学试剂有限公司;氯化钾,天津博迪化工股份有限公司;琼脂粉、蛋白胨,北京奥博星生物技术有限责任公司;酵母提取物,OXOID公司;TEO、Tween 80,上海源叶生物科技有限公司;磷钨酸,北京索莱宝科技有限公司;普通碳支持膜,北京中镜科仪技术有限公司。

微生物菌株:大肠杆菌CMCC 44102、铜绿假单胞菌CMCC 10104、枯草芽孢杆菌CMCC 63501、金黄色葡萄球菌CMCC 26003,上海保藏技术中心。

1.2 仪器与设备

Scientz-IID超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技有限公司;Zetasizer Nano ZS90纳米激光粒度仪,英国Malvern公司;HT7700-日立透射电子显微镜,日本Advanced Microscope公司;傅里叶红外光谱仪德国Bruker公司;SPX-150B-Z型生化培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 TEON的制备

使用超声粉碎机对TEO进行超声处理。制备相同超声功率下不同浓度的TEON,将1 mL的Tween 80和不同体积的TEO混合,定容至100 mL,于磁力搅拌器上混合5 min。将混合液在20 kHz的频率、380 W的功率下超声处理20 min,反应过程通过冰水浴控制体系温度为20 ℃。

在相同TEO浓度下,通过改变超声功率制备不同粒径的TEON,将1 mL的Tween 80和1.2 mL的TEO混合,定容至100 mL,于磁力搅拌器上混合5 min。设置不同超声功率,其余制备过程与上述一致。

1.4 接种物的制备

LB培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5,氯化钠10,pH 7.0。在121 ℃灭菌锅中灭菌20 min。

LB固体培养基(g/L):在LB培养基中加入16 g琼脂粉。

PBS缓冲液:4 g氯化钠、0.1 g氯化钾、0.71 g无水磷酸氢二钠和0.135 g磷酸二氢钾,将混合物定容至400 mL,调pH值至7.4,定容至500 mL。

以上培养基均在121 ℃灭菌锅中灭菌20 min。

1.5 乳液粒径的测定

使用纳米粒度仪在173°的散射角下通过动态光散射(dynamic light scattering, DLS)测量油滴尺寸。为避免多重散射效应,测量前用去离子水对TEON进行稀释。

1.6 透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察液滴形态

用TEM观察TEON的微观结构。在TEM观察前,样品用去离子水以1∶100的比例进行稀释,将稀释后的TEON置于普通碳支持膜上,等待干燥后,用2%的磷钨酸水溶液负染15 min,滤纸吸干多余液体,干燥后观察。

1.7 傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)

TEON的FT-IR于衰减全反射(attenuated total reflection, ATR)模式下在4 000～500 cm-1进行记录。

1.8 抗菌活性的测定

采用平板计数法检测抗菌活性。4种微生物接种在LB培养基中,于摇床培养12 h(37 ℃,200 r/min),得到细菌菌悬液。使用PBS缓冲液对菌悬液进行梯度稀释,使1 mL菌悬液在20 mL的LB固体培养基中的菌落数为30～300 CFU,做空白对照组。取10 mL稀释过的菌悬液,分别加入适量TEON,并通过0.45 μm 过滤器过滤灭菌,使1 mL混合液在20 mL的LB固体培养基中的菌落数为0～300 CFU。将接种后的培养皿(直径9 cm)放入37 ℃培养箱中,48 h后观察细菌菌落数。

1.9 数据处理与分析

使用Nano Measure 1.2软件对TEM图片进行粒径分析,使用OriginPro 9.0软件对试验数据进行绘图,抗菌试验每组设置3个平行,用SPSS 20.0软件进行差异显著性分析,结果以平均值±标准差表示,以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 TEON的形态

采用纳米粒度仪和TEM对TEON的粒径分布情况和形态进行表征分析,以便直观地观察TEON的微观结构。如图1和图2所示,1.2%(体积分数)的TEO在380 W的超声功率下获得的TEON的平均粒径在50 nm左右,乳化后的TEON清晰可见,液滴的形态呈现球形,尺寸分布均匀,与纳米粒度仪分析结果相似,两者微小差异可能是DLS测量过程中,乳液球体倾向于包裹在水膜中,导致数值偏大[17]。

图1 TEON的粒径分布Fig.1 The droplet size distribution for TEON

图2 TEON的透射电子显微镜图像Fig.2 Transmission electron microscope image for TEON

2.2 FT-IR分析

图3 相同TEO浓度、不同超声功率下制备的TEON的FT-IR光谱Fig.3 FT-IR Spectra of TEON prepared at the same concentration of TEO and different ultrasonic power

2.3 TEO浓度对抗菌性的影响

不同TEO浓度下制备的TEON的粒径大小如图4 所示,当添加0.7%～1%(体积分数)的TEO时,TEON的平均粒径随浓度增加而减小。体积分数为1.1%～1.7% 时,TEON的平均粒径随浓度增大而增大,并且平均粒径在100 nm以内,表明在此浓度区间内通过超声处理均能获得NEs[8]。并且在TEO和Tween 80为1∶1比例时得到最小粒径的TEON。在后续浓度与抑菌效果的关系研究中,为控制菌落数在0～300 CFU,并且菌落数小于空白对照组,选择TEO体积分数为1%～1.7%。

图4 不同TEO浓度下制备的TEON粒径Fig.4 The droplet size diagram of TEON prepared at different concentration of TEO注:数据表示为3次测定平均值±标准差(下同)

2.3.1 TEO浓度对革兰氏阴性菌抑菌性能的影响

对革兰氏阴性菌的抗菌特性的探究中,选取了大肠杆菌和铜绿假单胞菌2个典型的菌株。为控制空白对照组的菌落数在30～300 CFU,将大肠杆菌菌悬液梯度稀释到10-7,又为了方便观察TEON对大肠杆菌的影响规律,各浓度梯度均添加0.8 mL的TEON用于抗菌性研究。如图5所示,相较于未添加TEON的空白对照组,添加了TEON的实验组随着TEO浓度的增加,细菌生长受到抑制,菌落数显著减少(P<0.05)。当TEO体积分数达到1.7%之后,大肠杆菌无法生存。

图5 不同TEO浓度下制备的TEON对大肠杆菌的抑菌效果Fig.5 The bacteriostatic effect of TEON perpared at different concentration of TEO on Escherichia coli注:图中对照为未添加精油,不同字母表示存在显著差异(P<0.05)(下同)

将铜绿假单胞菌菌悬液梯度稀释到10-6,并添加0.5 mL的TEON。如图6所示,相较于空白对照组,添加了TEON的实验组,当TEO浓度达到一定后,随着浓度的增加,细菌生长受到抑制,菌落数显著减少(P<0.05)。由此可以判断,随着TEO浓度的增加,其对TEON革兰氏阴性菌的抗菌性也逐渐提升,与FADLI等[20]研究结论一致。本研究通过对多组浓度梯度进行探究,更具说服力,也便于观察浓度与抑菌性之间的规律关系。

图6 不同TEO浓度下制备的TEON对铜绿假单胞菌的抑菌效果Fig.6 The bacteriostatic effect of TEON perpared at different concentration of TEO on Pseudomonas aeruginosa

2.3.2 TEO浓度对革兰氏阳性菌的抑菌性能的影响

对革兰氏阳性菌的抗菌特性的探究中,选取了金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌2个典型的菌株。将金黄色葡萄球菌菌悬液梯度稀释到10-7,添加0.5 mL的TEON。如图7所示,相较于空白对照组,随着TEO浓度的增加,细菌生长受到抑制,菌落数显著减少(P<0.05)。当TEO体积分数达到1.7%之后,金黄色葡萄球菌生长完全受到抑制。

图7 不同TEO浓度下制备的TEON对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.7 The bacteriostatic effect of TEON perpared at different concentration of TEO on Staphylococcus aureus

将枯草芽孢杆菌菌悬液梯度稀释到10-5。当添加0.2 mL的TEON时,所有浓度下都未显示出其对枯草芽孢杆菌的抗菌性,但当添加0.25 mL的TEON时,所有浓度下枯草芽孢杆菌几乎全部失活,这可能与枯草芽孢杆菌特殊的细胞结构有关。

以上结果表明,革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对TEON更敏感。但GUERRA-ROSAS等[21]研究发现,与革兰氏阳性菌相比,革兰氏阴性菌对柠檬草精油纳米乳液更加敏感。造成研究结果不同的原因,可能是因为不同微生物物种的细胞包膜的结构存在差异,而且不同的微生物种对不同的EOs的NEs也表现不同反应。

2.4 乳液粒径对抗菌性的影响

控制TEO体积分数为1.2%,其他超声条件一致,仅改变超声功率,获得的TEON的粒径大小如图8 所示。随着超声功率的增加,TEON的粒径逐渐减小,但是变化幅度也越来越小,说明当超声功率达到一定强度后,对粒径的影响有限。

图8 相同TEO浓度下制备不同粒径的TEON粒径Fig.8 The droplet size diagram of TEON with different droplet size perpared at the same concentration of TEO

2.4.1 粒径对革兰氏阴性菌的抑菌性能的影响

TEON对大肠杆菌的抗菌性能如图9所示,当超声功率达到333 W之后,随着NE粒径的减小,不同粒径之间的抗菌性能不存在显著差异。但当功率为285 W时,存在显著差异(P<0.05),这说明当粒径差异较大时,粒径大小能够影响NEs对大肠杆菌的抗菌性能。

图9 不同粒径TEON对大肠杆菌的抑菌效果Fig.9 The bacteriostatic effect of TEON with different droplet size on Escherichia coli

TEON对铜绿假单胞菌的抗菌性能如图10所示,随着粒径的减小,不同粒径乳液球体的抗菌性能出现显著差异(P<0.05),即抗菌性能逐渐增加。这可能是因为较小尺寸的液滴具有更大的比表面积,能够让NEs与细胞膜更加充分地接触,从而使细胞活力快速丧失[22]。

图10 不同粒径TEON对铜绿假单胞菌的抑菌效果Fig.10 The bacteriostatic effect of TEON with different droplet size on Pseudomonas aeruginosa

2.4.2 粒径对革兰氏阳性菌的抑菌性能的影响

TEON对金黄色葡萄球菌的抗菌性能如图11所示,随着粒径的减小,不同粒径乳液球体的抗菌性能不存在显著差异。TEON的粒径大小对抑制金黄色葡萄球菌的生长没有影响,LIAO等[23]研究得出类似的结论。

图11 不同粒径TEON对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.11 The bacteriostatic effect of TEON with different droplet size on Staphylococcus aureus

将枯草芽孢杆菌菌悬液梯度稀释到10-5。当添加0.2 mL的TEON时,所有粒径下都未显示出其对枯草芽孢杆菌的抗菌活性,但当添加0.25 mL的TEON时,所有浓度下枯草芽孢杆菌几乎被完全杀死,这与添加不同浓度TEO制备的NEs时的结果一样。

3 结论

通过超声制备不同浓度和粒径的TEON,对几种典型革兰氏细菌的抑菌性能进行了检测分析。结果表明,TEON抗菌性能随着TEO浓度的增加而增强,当控制TEO浓度不变,制备不同粒径的TEON,随粒径的减小,抗菌性能得到提升,且革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更易受到影响。对于枯草芽孢杆菌而言,可能是因为特殊的细胞结构,其对TEON的敏感性大于其他种类的菌株,可在后续深入研究NEs对芽孢类细菌的作用机制。NEs作为一种极具前景的抗菌剂,有效地调控其浓度和粒径,为NEs用于提高营养物质的生物利用度,改善生物活性化合物的递送等研究打下基础。