王晓磊 姜彤彤 张洁 刘美学 刘云国 隋智海

摘 要：为探究临沂市某草鱼养殖场发生病害的原因，从患病的草鱼（ Ctenopharyngodon idellus ）肝脏和肾脏混合组织中分离得到一株优势致病菌G-13，通过细菌形态学观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因测序，以及系统发育分析等完成菌株鉴定，并测定其耐药特性。形态特征显示G-13是一种短杆状的革兰氏阴性菌，在LB固体平板上形成乳白色、圆形、整体呈隆起状、边缘较为整齐、表面光滑湿润的菌落；16S rRNA系统发育进化分析发现G-13与荧光假单胞菌（ Pseudomonas fluorescens ）聚在一支，序列同源性高达100%；生理生化试验显示葡萄糖、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、无盐和3% NaCl胰胨水等7项指标为阳性，与假单胞菌属特征相近，确定分离株G-13为 P. fluorescens 。药敏试验结果显示菌株G-13对丁胺卡那、多西环素、四环素、新霉素、环丙沙星、氧氟沙星等13种抗生素敏感，对氨苄西林、头孢拉定、克林霉素、呋喃唑酮等7种抗生素耐药。

关键词：草鱼（Ctenopharyngodon idellus）；荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）；生理生化；16S rRNA；药敏实验

草鱼（ Ctenopharyngodon idellus ）是我国重要的淡水养殖鱼类之一，被誉为“中国四大家鱼”， 其产量在2020 年高达557.11 万吨[1]。因其肉质蛋白质含量高，脂肪含量低，广受消费者青睐，具有较高的经济价值[2]。但随着养殖规模扩大和集约化程度提高，草鱼在养殖过程中容易受到气单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属等细菌感染，影响了其生长发育，可引发大面积死亡，阻碍养殖业的发展[3]。

荧光假单胞菌（ Pseudomonas fluorescens ）属于假单胞菌属，是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界如土壤、水、食物和空气中[4]。 P. fluorescens 是鱼类养殖中常见的病原菌，可感染鲟、半滑舌鳎、虹鳟等，引起赤皮病、败血症等病症，造成经济损失[5-7]。随着抗生素及其他药物不合理使用， P. fluorescens 产生了对青霉素、头孢他定、红霉素等抗生素的耐受性，给治疗带来困难和挑战[8-10]。

2021年5月山东省临沂市河东区某草鱼养殖场暴发疾病，出现游动缓慢，食欲减退，鳞片脱落伴随皮肤溃烂，臀鳍基部充血，肛门红肿，腹腔充血，肝脏肿大。为确定本次草鱼病害的病原菌，本研究从濒临死亡的草鱼肝肾混合组织中分离纯化细菌，通过分离纯化细菌、形态特征观察、革兰氏染色、生理生化特性分析、16S rRNA序列分析以及构建系统发育进化树分析等方法鉴定细菌种类，利用纸片扩散法分析其耐药性，可为草鱼养殖业有效防控提供有力的科学参考和治理方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉（北京拜尔迪生物技术有限公司）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；琼脂糖、DNA分子量标准 Marker （100～2 000 bp，生工生物工程（上海）股份有限公司）；50×TAE、6×DNA上样缓冲液（宝日医生物技术（北京）有限公司）；2×Taq PCR MasterMix、细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302）（天根生化科技（北京）有限公司）；革兰氏染色液试剂盒（HB8278）、生理生化鉴定管（青岛海博生物有限公司）；药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）。

1.1.2 主要设备 生物安全柜BSC-1304IIA（苏州安泰空气技术有限公司）、低速研磨器（天根生物有限公司）、臺式离心机Pico-21（Thermo Fisher）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、凝胶成像系统FR-1000（上海复日科技有限公司）、PCR仪ETC 811（北京东胜创新生物科技有限公司）、恒温摇床QYC-200（上海福玛实验设备有限公司）、培养箱DMJM-358（宁波江南仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 优势菌株分离纯化 75%乙醇擦拭体表，无菌解剖鱼体，挑取部分肝脏和肾脏于100 μL PBS中并研磨，10倍稀释后涂布在LB固体平板上，置于28 ℃恒温培养 24 h。根据菌落的形态、大小等特征进行分类，选取优势菌株在LB固体平板上划线纯化2次后，挑取单菌落于LB液体培养基中，28 ℃摇床培养16 h，加入终浓度为20%的甘油，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 细菌形态特征观察 用无菌接种环从保菌管中蘸取菌液于LB固体平板划线， 28 ℃过夜培养，观测菌落形态特征。从平板上挑取单菌落于生理盐水中制备成菌悬液，根据革兰氏染色液试剂盒说明书，将细菌悬液涂布在载玻片上，经结晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脱色、沙黄复染和自然干燥后，光学显微镜下观察其形态特征。

1.2.3 生理生化特性鉴定 用无菌接种环从平板上挑取3个单菌落于无菌水中，调整成 0.5 麦氏浊度的菌悬液，滴加 50 μL菌悬液至生理生化鉴定管中，用封口膜密封，静置培养24～48 h，观察各生化鉴定管的现象并记录。

1.2.4 16S rRNA扩增及其序列分析 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取细菌基因组DNA作为扩增模板。利用16S rRNA通用引物（27F： AGAGTTTGATCATGGCTCAG和1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增菌株16S rRNA序列，预期大小约为1 400 bp。PCR反应体系（50 μL）：基因组DNA 1 μL、2×Taq Master Mix 25 μL、27F（10 μmol/L）2.5 μL、1 492 R（10 μmol/L）2.5 μL、无菌水19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃保温10 min。取5 μL PCR产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测并送到上海生工生物有限公司测序。

根据测序结果利用NCBI的BlastN在线比对分析该菌株的16S rRNA序列与GenBank数据库中序列的相似性；在比对结果中挑选20个序列，运用MEGA X软件，利用Bootstrap法，设置1 000次，构建Neighbor-joining系统发育树，确定其进化地位。

1.2.5 耐药特性测定 利用纸片扩散法进行药敏试验，28 ℃过夜培养细菌，按照1%转接至新鲜LB液体培养基中，28 ℃振荡培养至OD600约为0.8左右（浓度约为2.4×108 CFU/mL），将100 μL菌液均匀涂布在LB平板上，待菌液干燥后，贴上药敏纸片，28 ℃静置培养24 h，观察细菌生长情况，用游标卡尺测量抑菌圈大小，对照药敏纸片说明书判断该菌对抗生素的敏感性。

2 结果与分析

2.1 菌落形态特征

从濒死的草鱼肝脏和肾脏混合组织中分离纯化出一株优势菌，命名为G-13。该菌在LB固体平板上28 ℃培养24 h，形成乳白色、圆形、整体呈隆起状、边缘较为整齐、表面光滑湿润的菌落（封三，图1A）；经革兰氏染色后，细菌呈现短杆状和红色，这表明该菌是一种革兰氏阴性菌（封三，图1B）。

2.2 生理生化鉴定

经过生理生化鉴定管试验，其结果显示：菌株G-13可分解葡萄糖，但不能发酵蔗糖、甘露糖、乳糖、甘露醇、纤维二糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖苷等；精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶等4项试验呈阳性；可在无盐和3%NaCl胰胨水中生长；V-P试验、尿素酶、明胶酶、6%～10% NaCl胰胨水、ONPG等试验结果为阴性（见表1）。

2.3 16S rRNA 序列分析及系统发育分析

利用基因组试剂盒提取G-13基因组DNA，并以其为模板，利用通用引物27F/1 492R扩增菌株16S rRNA基因序列。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：G-13基因组DNA条带单一，比较完整；16S rRNA扩增条带单一，无非特性扩增，条带大小在1 000～2 000 bp之间，与预期结果相符合，阴性对照无条带（封三，图2）。

将该菌株的16S rRNA序列与GenBank中序列进行BlastN比对，发现该菌与荧光假单胞菌 P. fluorescens  S16 （GenBank序列号：DQ095904.1）的同源性最高，高达100%。通过构建系统发育树，结果发现G-13菌株与 P. fluorescens 聚在一支，由此确定该分离菌G-13为 P. fluorescens （封三，图3）。

2.4 耐药特性分析

对分离株G-13完成20种抗生素敏感性试验，根据平均抑菌圈直径与杭州微生物试剂有限公司的药敏试验标准判断书对照，发现该菌株对7种抗生素（氨苄西林、头孢拉定、克林霉素、呋喃唑酮、羧苄西林、苯唑西林、麦迪霉素）表现出抗药性；对12种抗生素（丁胺卡那、多西环素、四环素、新霉素、环丙沙星、氧氟沙星、头孢哌酮、头孢曲松、诺氟沙星、米诺环素、多粘菌素、哌拉西林）则表现敏感性（表2）。根据水产养殖用药明白纸2020年2号，可考虑适当使用盐酸多西环素粉（水产用）和硫酸新霉素粉（水产用）来进行防治。

3 讨论与结论

草鱼是我国产量较大的淡水鱼类之一，但细菌性疾病也日益严重，制约了草鱼养殖业的健康可持续发展[11]。其中， P. fluorescens 是危害淡水养殖业的最常见病原菌之一，属于革兰氏阴性杆菌，广泛存在自然界中，具有较强的适应能力，宿主范围广，可感染包括鱼、虾、植物甚至人类等引起相应的疾病[12-13]。目前为止，已从多种鱼类包括鳜鱼、锦鲤、罗非鱼等分离出 P. fluorescens， 引起赤皮病、败血症、肝出血等临床症状，造成经济损失[14-16]。本研究从患有皮肤溃烂病的草鱼体内分离出一株优势革兰氏阴性菌株G-13，经过16S rRNA 基因克隆测序和系统发育分析并结合其生理生化特性，鉴定此分离菌株为 P. fluorescens  G-13。利用形态学、生理生化特征与分子生物学方法相结合，可更加准确诊断暴发鱼类疾病的病原菌，为其防治提供科学依据[17]。

目前针对鱼类皮肤溃烂病、烂鳃病、出血症等疾病的治疗方法主要是抗菌药物。但随着抗菌药物的不合理使用，会导致病原菌抗藥性和水体污染，给治疗带来困难，同时也威胁着人类健康[18]。通过分析 P. fluorescens  G-13对不同抗生素的敏感性，其结果显示 P. fluorescens  G-13对丁胺卡那、多西环素、四环素、新霉素、环丙沙星等13种抗生素都有不同程度的敏感性，可根据水产用药规定，选择合适的敏感药物如盐酸多西环素粉（水产用）和硫酸新霉素粉（水产用）进行相应的治疗；但也发现了其对氨苄西林、头孢拉定、克林霉素、呋喃唑酮等7种抗生素耐受，需要在用药时规避多重耐药的风险。

本研究利用传统分离培养法结合分子生物学方法，对患病的草鱼完成了病原菌的分离和鉴定，发现了一株荧光假单胞菌G-13，通过药敏试验确定了其对不同抗生素的敏感程度不同，可考虑使用敏感药物防治，同时规避耐受抗生素的使用，该研究结果可为临沂市草鱼养殖过程中荧光假单胞菌的感染和防治提供理论基础和科学依据。

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Abstract：In order to explore the causes of disease in a grass carp （ Ctenopharyngodon idellus ） farm in Linyi City， Shandong Province， a dominant pathogenic bacteria G-13 was isolated from the mixed tissues of liver and kidney of diseased grass carp. The strain was identified by bacterial morphological observation， gram staining， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA gene sequencing， and phylogenetic analysis， and its drug resistance characteristics were determined. The results showed that G-13 was a short rod-shaped gram-negative bacterium， which formed milky white， round， overall raised， neat edges， smooth and moist colonies on LB agar plates. 16S rRNA phylogenetic analysis showed that G-13 and  Pseudomonas fluorescens  were clustered together， and the sequence homology was as high as 100%. Physiological and biochemical tests showed that seven indexes including glucose， arginine dihydrolase， ornithine decarboxylase， lysine decarboxylase， oxidase， salt-free and 3% NaCl peptone water were positive， which were similar to the characteristics of the genus  Pseudomonas.  Then， the isolate G-13 was identified as  Pseudomonas fluorescens.  The results of antibiotic susceptibility test showed that strain G-13 was sensitive to 13 antibiotics such as bumicana， doxycycline， tetracycline， neomycin， ciprofloxacin and ofloxacin， and was resistant to 7 antibiotics such as ampicillin， cefaradine， clindamycin and furazolidone.

Key words：grass carp（ Ctenopharyngodon idellus）; Pseudomonas fluorescens;  physiology and biochemistry; 16S rRNA; antibiotic susceptibility test（收稿日期：2023-02-15）