杨福华 刘韶娜 廖隽锐 常雅洁 李新荣 霍金龙 赵智勇

（1．云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2．云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224）

近年来，随着畜牧产业结构调整，牛羊养殖集约化、规模化模式日趋壮大，对饲料的需求量不断增加[1]。常规饲料已无法满足畜牧业生产需要，因此对非常规饲料进行开发尤为重要[2-3]。青贮饲料是畜禽生产的重要饲料来源之一，青贮发酵可以抑制有害菌生长[4]，延长饲料的存放时间，保留饲料的营养价值，解决饲料供给不足问题[5]。青贮剂能够改善饲料营养状况，降低纤维含量，增加适口性，是非常规饲料的首选制作方法[6]。

芽孢杆菌（Bacillus）是一类生物多样性广、抗逆性强且安全无害的有益菌群。芽孢杆菌可快速营造厌氧环境[7]，产生抗菌活性物质，抑制病原菌的生长繁殖[8]。芽孢杆菌处理后的饲料，中性洗涤纤维（NDF）和淀粉的消化率有所提高[9]。目前，芽孢杆菌制剂已在饲料发酵等领域表现出巨大潜力。有研究表明，添加枯草芽孢杆菌能够降低饲料的pH值和氨态氮含量[10-11]。

蚕豆秸秆质地硬、适口性差，若作为粗饲料的来源，利用时间短且利用率低[12-13]。但蚕豆秸秆能够改善母猪繁殖性能[14]，增加奶牛产奶量[15]，提高山羊生产性能[13]。为充分合理利用蚕豆秸秆资源，提高蚕豆副产品效益，本研究将分离纯化后的芽孢杆菌经特性研究鉴定后接种到蚕豆秆中发酵，以青贮饲料感官评价和营养成分变化确定芽孢杆菌对蚕豆秸秆青贮品质的影响，为蚕豆秸秆的高效利用及青贮品质的提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

菌株样品分离自半散养条件下5 头地方猪的新鲜猪粪混合物；蚕豆秸秆来自云南省畜牧兽医科学院种植园。

1.1.2 培养基

LB 肉汤培养基：蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、葡萄糖1.0 g、酵母膏粉5.0 g，调节pH 值至6.8～7.2 范围内，超纯水定容至1 L，121 ℃条件下灭菌20 min。

LB 琼脂培养基：配方同LB 液体培养基，添加琼脂粉20 g/L。

营养（NA）肉汤培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g，121℃条件下灭菌20 min。

营养（NA）琼脂培养基：配方同营养（NA）肉汤培养基，添加琼脂粉20 g/L。

1.1.3 试剂与仪器

卡那霉素（k30）、庆大霉素（cn10）、青霉素（p10）购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

SX-500 高压蒸汽灭菌器（TOMY-KOGYOCO.LTD）、SW-CJ1FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、PHS-3C pH计（雷磁，上海仪电科学仪器有限公司）、CCH-HIGHPOINT20实验室超纯水机（湖南创纯水处理设备有限公司）、ZQLY-180GV 振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）、UV-9000S 紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、1000 型高速多功能粉碎机（武义海纳电器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 芽孢杆菌的分离纯化

取半散养条件下的5 头地方育肥猪的新鲜猪粪的混合样品5 g，置于250 mL LB肉汤培养基中，在30 ℃恒温培养箱中富集培养24 h，80 ℃水浴20 min，使用0.9%的生理盐水做梯度稀释后选择10-5倍稀释液，用接种环将菌液上清液接种于LB 琼脂培养基，30 ℃恒温培养箱培养24 h。分别挑取具有典型芽孢杆菌形态的单菌落到LB肉汤培养基中培养。反复挑斑，经过4 代筛选后筛选到菌落形态一致的单菌落，于30%的甘油中-20 ℃保存。

1.2.2 形态学观察和革兰氏染色

将复筛获得的菌株利用接种棒划线于LB固体培养基平板上，30 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，观察菌落的隆起形状、透明度、颜色、质地、边缘等，挑取少许单菌落进行革兰氏染色后置于光学显微镜下观察。

1.2.3 分子生物学鉴定

使用试剂盒提取总DNA作为模板，采用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 进行PCR 扩增。电泳检测PCR 产物，大小约1.5 kb，产物交到擎科生物技术有限公司测序。测序结果提交GenBank 进行Blast比对分析，并选取同属内近缘种的16S rRNA基因序列，采用MEGA 11.0软件和利用MegAlign分析氨基酸序列同源性比对，构建系统发育树。

1.2.4 生长曲线及产酸特性

将筛选的芽孢杆菌在LB液体培养基中活化（30 ℃、100 r/min过夜）。另配制LB液体培养基并分装于100 mL锥形瓶，每个锥形瓶中接种预先过夜培养的菌液100 μL，放入30 ℃恒温培养箱中振荡培养，每隔2 h 快速吸取每种菌液5 mL 测定pH 值和OD600nm吸光度值。统计测量结果并绘制芽孢杆菌生长曲线和pH值变化曲线。

1.2.5 抗生素的耐药性

采用药敏纸片扩散法检测芽孢杆菌对3 种抗生素的耐药性。以1%接种量将测试菌株菌液接入50 ℃左右的经高压蒸汽灭菌的LB琼脂固体培养基中，摇匀，倒入平板中。将含有定量抗生素[卡那霉素（k30）、庆大霉素（cn10）、青霉素（p10）]的滤纸片贴在已接种了测试菌的LB琼脂培养基表面，30 ℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌圈的大小。根据《抗菌药物敏感性试验执行标准》[16]判断细菌对抗生素的敏感性效果。抑菌圈直径小于10 mm，不敏感；直径10～15 mm，中度敏感；直径大于15 mm，敏感[17]。

1.2.6 菌株对蚕豆秆青贮发酵的影响

收割采摘蚕豆后的蚕豆秸秆，含水率为75.17%，用微型粉碎机将蚕豆秸秆的粉碎长度为5～10 mm，按1∶0.4的比例与米糠混匀。试验组添加试验菌株YF-15，添加量为106CFU/g，对照组加入同等体积的无菌水，混匀后每袋1 000 g样品装入发酵袋，压紧，排出空气，密封，放在室外避光发酵。30 d 后进行常规成分分析和青贮饲料质量的评定。参照《食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）[18]测定灰分（Ash）含量，参照《食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）[19]测定粗蛋白（CP）含量，参照《食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）[20]测定粗脂肪（EE）的含量，按国标方法检测水分、粗纤维、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维含量，青贮饲料质量评定参照德国农业协会（DLG）评分标准，对气味、结构、色泽进行评分，分为优、上、中、下等[21]。评分细则见表1。实验室测定指标包括青贮饲料的pH 值和营养成分，以表1判断青贮饲料发酵情况[22]。

表1 DLG推荐的青贮饲料质量感官评分标准

2 结果与分析

2.1 分离株形态观察和革兰氏染色结果

从半散养地方猪育肥猪的新鲜猪粪中筛选得到一株有孢子、革兰氏染色呈阳性的芽孢杆菌，菌落形态及革兰氏染色镜检结果见图1。由图1 可知，菌株在LB 固体培养基上单菌落呈圆形，表面光滑，边缘规则，颜色为灰白色；经过革兰氏染色后，表现为革兰氏阳性、杆状、单一或串生、有芽孢，分离菌株命名为YF-15。

图1 分离株形态观察和革兰氏染色结果

2.2 菌株YF-15的分子鉴定结果

根据北京擎科生物科技有限公司（昆明）测定的DNA 序列，获得1 405 bp 的序列长度，将测序结果提交GenBank获得登录号为OP349652，通过Blast序列比对以及利用MegAlign进行序列同源性比对，结果见图2。

图2 菌株的同源性比对

由图2 可知，芽孢杆菌YF-15 与阿氏芽孢杆菌（MT525305.1）的相似性达到了96%；与阿氏芽孢杆菌（MT538470.1）、清生芽孢杆菌（MT353876.1）、巨大芽孢杆菌（MT279338.1）、巨型芽孢杆菌（MH127618.1）、惠州芽孢杆菌（MK618613.1）、苍白杆菌（KU877680.1）相似性达到了98%。

菌株YF-15的16S rDNA系统发育树见图3。由图3可知，菌株YF-15和巨型阿氏芽孢杆菌（MH748616.1）在同一分支，提示两者的亲缘关系较近。

图3 菌株YF-15的16S rDNA系统发育树

2.3 菌株YF-15的生长曲线和pH值变化曲线（见图4）

图4 菌株YF-15的生长曲线和pH值变化曲线

由图4（a）可知，菌株YF-15 在30 ℃的LB 液体培养基中能够正常生长且可达到较高的浓度，培养到2 h快速生长，4 h 时后生长逐渐减慢，14 h 后生长逐渐平缓，进入稳定期，20 h后进入稳定后期。

由图4（b）可知，菌株YF-15 菌液的pH 值在2～4 h内快速降低，4 h后逐渐上升，表明芽孢杆菌的生长消耗了培养液中的酸性营养物质。培养至16 h时，菌液pH值变化趋于平缓，但随着菌株生长，消耗了菌液中的酸性物质，pH值持续升高。

2.4 菌株YF-15对抗生素的耐药性（见表2）

表2 菌株YF-15对抗生素的耐药性

由表2 可知，菌株YF-15 对青霉素（p10）不敏感，对卡那霉素（k30）和庆大霉素（cn10）为中度敏感。

2.5 菌株YF-15对蚕豆秸秆青贮的感官及营养成分的影响（见表3、表4）

表3 菌株YF-15对蚕豆秸秆青贮感官评价的影响

表4 菌株YF-15对蚕豆青贮饲料常规营养成分含量的影响 单位：%

由表3、表4可知，试验组蚕豆秸秆青贮的气味评分和pH 值均优于对照组，CP、EE 含量均高于对照组，DM、Ash、CF、ADF和NDF含量均低于对照组。

3 讨论

3.1 芽孢杆菌的生物特性分析

芽孢杆菌广泛存在于土壤、动物肠道、植物体、空气以及水体等环境中，是动物肠道内的主要菌群之一。芽孢杆菌具有抗逆性强、营养要求低、繁殖速度快、稳定性好等优点[23]，具有改善动物胃肠道的功能，可增强动物免疫力，提高动物生产性能[24-25]。

本研究从半散养育肥猪的新鲜猪粪中筛选分离到一株芽孢杆菌，经常规特征观察、革兰氏染色以及生长趋势、产酸性能、抗生素耐受性分析，并经16S rDNA测序后鉴定得到菌株的序列信息，将测序结果提交GenBank获得的登录号OP349652。该芽孢杆菌YF-15 能够在LB琼脂培养基中生长良好，主要包括迟缓期、对数期、稳定期，在测定的24 h内未出现衰亡期；菌株在2 h时开始快速生长，4 h 后生长逐渐平缓，进入稳定期。夏超笃等[26]研究了一株解淀粉芽孢杆菌的生长规律，发现菌株在4～6 h 后进入对数生长期，12 h 后进入稳定期。王君等[27]研究了一株地衣芽孢杆菌生长规律，发现培养4 h后菌株生长进入对数期，此时活菌数开始迅速上升，在第12 h 进入稳定期。本研究结果显示，芽孢杆菌YF-15 菌液的pH 值可维持在7.0 左右，且随着菌株生长pH 值在5.5～7.5 范围内变化。刘军生等[28]对一株阿氏芽孢杆菌的产酸试验结果表明，菌株生长最适pH 值约7.0，在6.0～7.5范围内生长良好，无法在强酸或强碱的环境中生长。

本研究通过Blast 序列比对分析了多菌株序列同源性，并构建了进化树，菌株YF-15 与其他芽孢杆菌的相似度均在98%以上。进化分析结果表明，菌株YF-15 和MT748616.1Priestiaaryabhattai在同一分支，提示芽孢杆菌YF-15 与该菌株的亲缘关系较近。抗生素能够杀死敏感的有益菌，留下耐药菌株。这些菌株的数量会随着时间的推移而增加，并可能成为耐药菌株。为使有益菌发挥最大的作用，在使用有益菌时应避免与其敏感的抗生素一同使用[29]。菌株YF-15 的抗生素耐药性试验结果表明，该菌株对青霉素（p10）不敏感，对卡那霉素（k30）和庆大霉素（cn10）为中度敏感。菌株YF-15 对所试验抗生素的耐药性表现优于前人研究，表明芽孢杆菌YF-15可在含有一定量抗生素的环境中生长[17,30-31]。

3.2 芽孢杆菌作为青贮添加剂对蚕豆青贮发酵效果的影响

将从新鲜猪粪中分离的芽孢杆菌YF-15 添加到蚕豆秸秆青贮饲料后，青贮饲料的气味评分和pH值评分均优于对照组，常规成分检测发现饲料的EE、CP等含量高于对照组，并且CF 含量显著降低。试验组的ADF 和NDF较对照组分别降低了18.81%和7.68%，说明芽孢杆菌YF-15 对CF 具有较强的降解能力，并且还具有提高EE和CP 含量的能力，可使饲料营养物质得到较好的保存。产生这些变化的原因可能是因为青贮饲料在发酵过程中，芽孢杆菌的生长、发酵影响了蚕豆的细胞壁结构，细胞内容物大量流出，与微生物进行各种反应，从而导致色泽、气味、质地和pH值等发生了变化。有研究表明，添加青贮添加剂对青贮饲料的色泽、气味、质地和pH值有所改变[32]。青贮饲料的原料中含有大量的微生物，而有害微生物是造成饲料中营养成分减少的主要原因之一。在青贮发酵过程中添加有益菌可抑制有害菌的生长，从而降低饲料中营养物质的损失[33]。有研究发现，用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵桑叶可降低饲料CF 和EE含量，提高CP含量，与本研究结果相似[34-36]。有研究表明，NDF和ADF含量越高，饲料品质越差。有研究对蚕豆秸秆的洗涤纤维含量进行分析，发现NDF和ADF含量达到了55.08%和63.04%[37]。本试验中添加了米糠，导致NDF和ADF含量较高。也有研究表明，蚕豆秸秆对绵羊生长的NDF和ADF均无显著影响[38]。

4 结论

本研究从新鲜猪粪中筛选分离得到一株芽孢杆菌（Bacillus），命名为BacillusYF-15。对BacillusYF-15 的特性研究发现，该筛选菌株具有较好的生长性，对常见的抗生素具有一定的耐药性。将菌株YF-15 作为微生物添加剂对蚕豆秸秆发酵，能够提高蚕豆秸秆青贮饲料的CP、EE 的含量，降低DM、Ash、CF、ADF 和NDF 含量，提高感官评价水平。