吴晓玲 李力强 吴伟斌 张贵锋

摘要：目的  为了阐明活血消癥益气中药复方干预肝硬化的作用机制，探讨该复方对肝硬化模型大鼠肝功能、糖脂代谢紊乱、氧化损伤的影响。方法  SD大鼠40只适应性饲养1周后，随机分为空白组10只、造模组30只。空白组自由喂养，造模组采用四氯化碳复合法诱导构建肝硬化大鼠模型。选择24只造模成功的肝硬化模型大鼠随机分为模型组、吡非尼酮组、活血消癥益气方组，每组8只。模型组自由喂养，吡非尼酮组、活血消癥益气方组分别以吡非尼酮原药粉、活血消癥益气方中药配方颗粒悬浊液灌胃，每日1次，干预治疗8周。取大鼠肝脏组织和下腔静脉血，肝组织切片后采用HE及Masson染色电镜下观察肝组织纤维化情况，采用试剂盒检测大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil、GLU、Tg，SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平。结果  （1）空白组大鼠肝细胞大小均匀、排列整齐，未见明显坏死、变性及炎细胞浸润；模型组大鼠肝脏汇管区、小叶间可见大量胶原纤维增生，肝小叶结构破坏明显并伴有明显假小叶生成；吡非尼酮组、活血消癥益气方组大鼠肝组织纤维化、肝细胞炎性浸润程度均较轻，结缔组织增生少，肝细胞索排列比较整齐。（2）模型组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil、GLU、Tg，SOD、MDA、GSH、GSH-Px与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。经过8W的干预治疗，吡非尼酮组、活血消癥益气方组大鼠的AST、ALT、TBil、GLU、Tg，MDA水平显著低于模型组（P<0.01），ALB、SOD、GSH、GSH-Px水平显著高于模型组（P<0.01），TP水平与模型组比较，差异无统计学意义（P≥0.05）；活血消癥益气方组AST、ALT水平显著低于吡非尼酮组（P<0.01），TG显著高于吡非尼酮组（P<0.01），ALB、TBil、GLU、SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平与吡非尼酮组比较，差异无统计学意义（P≥0.05）。结论  活血消癥益气中药复方能有效改善肝硬化模型大鼠肝功能损伤、肝纤维化，作用机制可能与调控糖脂代谢紊乱及SOD、MDA、GSH、GSH-Px等氧化应激因子有关。

关键词：活血消癥益气方；肝硬化；糖脂代谢；过氧化物歧化酶；丙二醛；谷胱甘肽

中图分类号：R657.3+1      文献标志码：B      文章编号：1007-2349（2023）06-0076-06

肝硬化（hepatic cirrhosis，HC）是慢性肝病进展到以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成及肝内外血管增殖为主要特征的病理阶段^［1］，我国约有700万肝硬化患者，目前除了肝移植尚无有效治疗方法。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化阶段的必经阶段，有逆转的可能性，阻断肝纤维化向肝硬化转变是治疗各种慢性肝病的重要手段^［2］。研究表明，目前临床经过有效验证并得到公认的抗纤维化西药很少，而中医药对抗肝纤维化发挥着重要作用^［3］。鳖甲消癥丸是广东省名中医李力强教授发明的一种治疗肝病的中药院内制剂（粤药制字Z20070356，ZL20150670167.3），具有活血消癥益气之功效，已在临床应用30余年，能有效抗肝纤维化和改善乙型病毒性肝炎患者肝功能^［4］，为探索其作用靶点和疗效机制，进一步提高临床疗效，课题组观察了活血消癥益气方（鳖甲消癥丸原方）的中药配方颗粒剂对肝硬化模型大鼠肝功能损害、糖脂代谢紊乱、氧化损伤的影响，结果报告如下。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  实验動物  选择SD大鼠40只（实验动物许可证号SYXK（鄂）2017-0065）为实验对象，雌雄各半，适应性饲养1w，随机分为空白组（Blank group）10只、造模组（Module building group）30只。造模成功后的大鼠24只，随机分为模型组（Model group）、吡非尼酮组（Pirfenidone group）、活血消癥益气方组（Huoxue Xiaozheng Yiqi recipe group，HXXZYQ group），每组8只。空白对照组8只入组观察。

1.1.2  药物与试剂  中药配方颗粒（批号1808001w，华润三九医药股份有限公司生产）、吡非尼酮原料药粉（EB03028，购于上海士锋生物科技有限公司），高脂饲料（购自湖北省疾控中心动物实验中心），四氯化碳（货号C805332，购自上海麦克林生化科技有限公司），谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBil）试剂盒（货号C010-2-1、C009-2-1、A045-2-2、A028-2-1、C019-1-1，购自南京建成生物工程研究所），葡萄糖（GLU）/甘油三酯（TG）试剂盒（货号F006-1-1、A110-1-1，购自南京建成生物工程研究所），总过氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）、总谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（货号S0101M、S0131、S0056，购自上海碧云天生物技术有限公司）

1.2  方法

1.2.1  动物造模  参考相关文献^［5］采用四氯化碳复合法诱导造模：造模组大鼠给予高脂饲料+5%食用白酒溶液进行饲养，空白组用普通饲料及蒸馏水进行饲养。造模组第1～2 W按0.2mL/100 g体重给予40%（v/v）四氯化碳橄榄油溶液灌胃，第3～12W按0.2mL/100 g体重给予50%（v/v）的四氯化碳橄榄油溶液灌胃。空白组给予等量的橄榄油溶液。每周一、周四各灌胃1次，每周一大鼠称重1次，给药剂量根据体重调整。在第12W末，随机选择正常组、造模组大鼠各2只，乌拉坦麻醉后取下腔静脉血，检测血清AST、ALT含量，观察大鼠肝脏肿胀度，取肝组织HE染色及Masson染色后观察肝纤维化情况。将造模组与空白组进行对比，确定造模是否成功。

1.2.2  干预方法  大鼠每日给药剂量参考《药理实验方法学》进行换算。吡非尼酮组按照120mg/kg剂量给予吡非尼酮原药粉进行灌胃干预治疗，用小量温水将药物研磨为混悬液，加入适当体积的温水配置为灌胃液，再按照1mL/200 g体重灌胃。醋鳖甲1.5 g（相当于饮片15 g）、醋莪术1.5 g（饮片15 g）、醋三棱1.5 g（饮片15 g）、西洋参4.5 g（饮片15 g）、炙黄芪1 g（饮片10 g）、醋白芍1.5 g（饮片15 g）、炒白术1.67 g（饮片10 g）、茯苓1 g（饮片10 g）、生大黄7.5 g（饮片5 g）、生甘草1.25 g（饮片7.5 g）、人工麝香0.5 g，配方颗粒融入120mL沸水中震荡摇匀为混悬液冷却备用，按照1.23mL/100 g体重给活血消癥益气方组大鼠灌胃。空白对照组和模型对照组的大鼠给予等量生理盐水灌胃。每日干预1次，连续干预8周^［6-7］。

1.2.3  标本采集及指标检测  大鼠肝脏HE及Masson染色：将肝脏置于4%的多聚甲醛中固定24h以上，再制备成石蜡切片，HE染色及Masson染色后镜下观察肝组织损伤情况及纤维化程度。肝功能检测：大鼠下腔静脉血以肝素抗凝，血样3000转低温离心30min，再按照试剂盒说明书步骤对血样进行检测，所得检测结果换算为酶活力卡门氏单位。GLU/TG检测：取大鼠下腔静脉血置于灭菌的EP管内，斜放于冰浴中，待血液自然凝固后3000转低温离心5min，取血清用GLu/TG试剂盒对血样进行检测。SOD检测：用抗凝管收集大鼠下腔静脉血，顛倒混匀，3000转低温离心10min，取上清根据总SOD活性检测试剂盒说明书步骤对血样进行检测。MDA检测：取大鼠下腔静脉血置于灭菌过的EP管内，斜放于冰浴中，待血液自然凝固后4℃600 g低温离心10min，取血清使用试剂盒对血样进行检测。GSH/GSH-Px检测：取大鼠下腔静脉血以肝素抗凝，根据总GSH/GSH-Px检测试剂盒要求处理血样后，按说明书步骤对血样进行检测^［8］。

1.3  统计分析  结果数据采用均数±标准差表示（x±s），采用SPSS 22.0 for windows进行统计学分析，组间比较采用one-ANOVA进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  各组大鼠肝组织病理切片结果的比较

2.1.1  HE染色结果  空白对照组大鼠肝小叶结构正常，未见假小叶形成；肝细胞大小基本一致，细胞核居中，围绕-中央静脉呈条索状排列，未见肝细胞脂肪变性、坏死；汇管区无明显的炎症细胞浸润及纤维组织增生。模型组大鼠肝组织内可见大量的宽厚纤维增生，将肝小叶分割成大小不等的肝细胞结节，形成假小叶，肝索结构模糊；汇管区可见明显的纤维组织增生。吡非尼酮组和活血消癥益气方组可见纤细的纤维组织增生，部分区域可见假小叶形成；汇管区有少量纤维组织增生。见图1。

2.1.2  Masson染色结果  空白对照组的纤维组织位于汇管区周边，未见假小叶形成。模型对照组汇管区周边大量的纤维组增生，宽厚纤维组织向周边肝组织延伸，形成假小叶。吡非尼酮组和活血消癥益气方组可见染成蓝色的纤维组织增生，厚度中等并形成假小叶，但假小叶较模型对照组显著减少。见图2。

2.2  各组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil结果的比较  模型组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。经过8W的干预治疗，吡非尼酮组、活血消癥益气方组大鼠血清AST、ALT、TBil水平显著低于模型组（P<0.01），ALB水平显著高于模型组（P<0.01），TP水平与模型组比较，差异无统计学意义（P≥0.05）；活血消癥益气方组大鼠血清AST、ALT水平显著低于吡非尼酮组（P<0.01），而ALB、TBil水平与吡非尼酮组比较，差异无统计学意义（P≥0.05）。结果见表1。

2.3  各组大鼠血清GLU、TG结果的比较  模型组大鼠血清GLU、TG显著高于空白组（P<0.01）。经过8W的干预治疗，吡非尼酮组、活血消癥益气方组大鼠血清GLU、TG水平显著低于模型组（P<0.01）；活血消癥益气方组大鼠血清GLU水平与吡非尼酮组比较，差异无统计学意义（P≥0.05），TG显著高于吡非尼酮组（P<0.01）。结果见表2。

2.4  各组大鼠血清SOD、MDA、GSH、GSH-Px结果的比较  模型组大鼠血清SOD、MDA、GSH、GSH-Px与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。经过8W的干预治疗，与模型组比较，吡非尼酮组、活血消癥益气方组大鼠血清SOD、GSH、GSH-Px水平显著增高（P<0.01），MDA水平显著降低（P<0.01）；活血消癥益气方组大鼠血清SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平与吡非尼酮组比较，差异无统计学意义（P≥0.05）。结果见表3。

3  讨论

肝纤维化是肝脏细胞外基质的弥漫性过度沉积以及异常分布，是肝脏对各种慢性损伤的病理性修复反应，为各类慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键环节和影响慢性肝病预后的重要因素^［9］。由于肝纤维化是肝损伤后机体整体参与的一种修复反应，临床研究发现针对单一靶标的药物效果普遍不佳，目前尚无疗效明确的化学药物或生物药物，近几十年的研究和实践证实中医药在肝纤维化防治领域显示出疗效优势。我国已经批准的多个抗肝纤维化中药制剂在临床得到广泛应用，疗效确切，未见不良反应报道^［10］。广东省名中医李力强教授以《太平圣惠方》鳖甲丸为基础，研制了活血消癥益气的中药复方鳖甲消癥丸，用于治疗肝硬化、肝炎等，30余年的临床应用表明，该中药复方对预防肝硬化门静脉高压食管胃静脉破裂出血、抗肝纤维化等有显著效果^［11-12］，能明显改善肝硬化患者肝区疼痛、黄疸、腹水、蜘蛛痣、肝掌、舌边瘀斑、脾肿大等症状；显著降低门静脉压力和食管静脉压力，改善食管静脉曲张，预防食管胃静脉出血；改善肝纤维化，降低肝内血管和门体侧支血管阻力。

本研究发现，模型组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBil、GLU、Tg，SOD、MDA、GSH、GSH-Px与空白组比较有显著差异，模型组大鼠肝组织内大量宽厚纤维增生并分割正常的肝小叶，形成大小不等的肝细胞结节即假小叶；假小叶内肝细胞肝索结构模糊，肝细胞未见异型性；汇管区大量纤维组织增生。基于肝脏在糖脂代谢中的核心地位，各种病因所致肝硬化都可能影响肝脏调控糖脂代谢的功能，糖脂代谢紊乱可以继发于肝硬化，也可以是肝硬化的病因，或与肝硬化伴随发生^［13］。高琦等^［14］发现，肝硬化患者干预治疗后血糖及TC显著降低，提示随着病情的好转糖脂代谢紊乱得到了改善；宋健等^［15］发现，肝硬化患者糖脂代谢异常随着肝功能Child-Pugh分级增高而更加明显。氧化应激在肝纤维化的发生发展过程中发挥着重要作用，在各种疾病所致的肝纤维化过程中均有不同程度的氧化应激参与^［16-17］。SOD是一种抗氧化的酶，主要功能是保护氧化性损伤；MDA由多不饱和脂肪酸过氧化分解产生，被用来间接反应机体的自由基代谢变化及细胞的损伤程度^［18］；肝硬化患者血清中普遍存在SOD低表达、MDA高表达情况^［19-20］。GSH是重要的细胞抗氧化剂，能有效清除氧自由基，解毒脂质过氧化反应的亲电性产物，维持蛋白质的巯基状态，增强抗氧化能力，从而减轻肝纤维化^［21］。GSH-Px以GSH为底物和SOD、过氧化氢酶等一起清除机体活性氧，从而减轻和阻止活性氧的过氧化作用，研究显示肝硬化患者肝组织GSH-Px较正常人显著降低^［22-23］。临床研究证实吡非尼酮具有广谱抗肺、心、肝、肾纤维化及抗炎、抗氧化作用^［24］。近年来国内外研究发现^［25-26］，吡非尼酮能有效改善大鼠肝纤维化，作用机制可能与抑制脂质过氧化、减轻炎性反应、抑制肝星状细胞的活化及增殖、调节细胞外基质的合成与降解等有关，可通过抑制氧化应激产物MDA含量、增加SOD活性而减轻肝纤维化。在本研究中，吡非尼酮组大鼠较模型組大鼠肝纤维化、肝细胞炎性浸润程度均较显著减轻，结缔组织增生减少，肝细胞索排列比较整齐，血清AST、ALT、TBil、GLU、Tg，MDA水平显著低于模型组，血清ALB、SOD、GSH、GSH-Px水平显著高于模型组，这与既往研究结果一致，进一步证实了吡非尼酮治疗肝纤维化的有效性。

活血消癥益气方由醋鳖甲、醋三棱、醋莪术、人工麝香、西洋参、炙黄芪、醋白芍、炒白术、茯苓、生大黄、生甘草等组成；醋鳖甲入肝消积、软坚散结，麝香通窍活络、活血消癥，为君药；醋莪术与醋三棱活血行气、消癥止痛，为臣药；西洋参和炙黄芪补益气血、扶益正气，醋白芍柔肝止痛，炒白术和茯苓健脾益气、利水祛湿，共为佐药；生大黄活血化瘀、荡涤湿热，生甘草缓急止痛、调和诸药，共为使药。诸药合用，共奏益气活血、化瘀消癥之功效，标本同治。实验结果发现，经过8W的活血消癥益气方干预治疗，病理切片显示活血消癥益气方组大鼠肝组织纤维化、肝细胞炎性浸润程度明显减轻，结缔组织增生显著减少，肝细胞索基本排列整齐，血清AST、ALT、TBil、GLU、Tg，MDA水平显著低于模型组，血清ALB、SOD、GSH、GSH-Px水平显著高于模型组。表明活血消癥益气方可以显著改善肝硬化大鼠的肝纤维化和肝功能，作用机制可能与调控糖脂代谢紊乱及SOD、MDA、GSH、GSH-Px等氧化应激因子相关。活血消癥益气方组血清AST、ALT水平低于吡非尼酮组，TG高于吡非尼酮组，而TP、ALB、TBil、GLU、SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平与吡非尼酮组比较，差异无统计学意义，表明血消癥益气方改善肝硬化模型大鼠肝纤维化、糖代谢紊乱、氧化损伤的效果与吡非尼酮相当，而在改善肝功能、脂代谢紊乱方面的效果比吡非尼酮略差。

综上所述，经过8W的干预治疗，吡非尼酮组、活血消癥益气方组大鼠AST、ALT、ALB、TBil、GLU、Tg，SOD、MDA、GSH、GSH-Px与模型组比较，差异有统计学意义，病理切片结果提示肝纤维化、肝细胞损害明显好转，表明吡非尼酮、活血消癥益气方对肝硬化大鼠肝功能损伤、肝纤维化、糖脂代谢紊乱、氧化应激反应均能有效抑制或一定程度逆转。活血消癥益气方值得在临床用于肝硬化的治疗。

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（收稿日期：2022-11-10）