万晓君 许激扬

【摘要】目的：研究清溪花鳖肽的体内外抗氧化活性。方法：测定清溪花鳖肽体外对DPPH、·OH和·O2-自由基的清除作用。建立D-半乳糖致衰老模型小鼠，灌胃给予清溪花鳖肽，测定小鼠血浆和肝脏中的MDA（丙二醛）含量、CAT（过氧化氢酶）、T-SOD（超氧化物歧化酶）和GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶）的活力，研究清溪花鳖肽体内抗氧化活性。结果：清溪花鳖肽对DPPH、·OH和·O2-自由基的清除能力较强，IC50分别为2.45 mg/mL，4.36 mg/mL和6.95 mg/mL。而且，清溪花鳖肽能明显降低造模小鼠肝脏与血浆中MDA的含量，并可以切实提高CAT、SOD与GSH-Px活力。结论：清溪花鳖肽有很好的体内外抗氧化活性。

【关键词】清溪花鳖；多肽；抗氧化

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.034

Study on Antioxidant Activity of Qingxi Turtle Peptide

WAN Xiao-jun1，XU Ji-yang2*

（1.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China；2.School of Life Science and Technology，China

Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Abstract：Objective：To study the antioxidant activity of Qingxi turtle peptide in vivo and in vitro. Methods：the scavenging effects of Qingxi turtle peptide on DPPH，·OH and·O2-free radicals in vitro were determined. The aging model mice induced by D-galactose were established. Qingxi turtle peptide was given by gavage. The contents of MDA（malondialdehyde），cat（catalase），T-SOD（superoxide dismutase）and GSH-PX（glutathione peroxidase）in plasma and liver were measured to study the antioxidant activity of Qingxi turtle peptide in vivo. Results：Qingxi soft shelled turtle peptide had strong scavenging ability for DPPH，·OH and·O2-free radicals. The IC50 were 2.45 mg/mL，4.36 mg/mL and 6.95 mg/mL respectively. Moreover，the Qingxi turtle peptide can significantly reduce the content of MDAin the liver and plasma of the model mice，and can effectively improve the activities of CAT，SOD and GSHPx. Conclusion：Qingxi turtle peptide has good antioxidant activity in vivo and in vitro.

Key words：Qingxi turtle；peptide；antioxidant

衰老的分子機制复杂，其中Denham Harman提出的自由基损伤理论是目前广泛研究和认可的衰老学说[1]。机体在正常情况下，体内抗氧化系统可以清除多余的自由基，维持细胞内氧化还原平衡，包括谷胱甘肽（Glutathione，GSH）系统和超氧化物酶等。如果细胞内氧化还原平衡被打破，体内自由基积攒过多，会引发脂质过氧化，产生丙二醛（malondialdehyde，MDA），进而会加速机体衰老。研究表明，生物活性肽可以通过清除自由基从而保护细胞的正常功能，具有很好的延缓衰老的作用[2]。如朴美子等人发现中华真地鳖酶解短肽对常见自由基有较强的清除作用。如对·O2-、·OH和DPPH等自由基清除明显，IC50可以分别达到8.73、0.40、1.32 mg/mL[3]。鲍鱼内脏抗氧化肽对DPPH、羟自由基、ABTS自由基的IC50分别为4.6、16.24、17.41 mg/mL[4]。清溪花鳖肽是从清溪花鳖中得到的蛋白质酶解产物，已有研究发现清溪花鳖肽对尿酸钠所致大鼠痛风性关节炎有一定的治疗作用[5]，但清溪花鳖肽对其他生物活性尤其是抗氧化活性的研究还未见报道。本研究将从体内和体外两方面探讨清溪花鳖肽的抗氧化作用。

1材料与方法

1.1材料与试剂

清溪花鳖肽（浙江德溪生物科技有限公司），DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）（如无特殊说明，化合物购自合肥博美生物科技有限责任公司），三羟甲基氨基甲烷（Tris）（美国Sigma），抗坏血酸（aladdin），CAT（过氧化氢酶）试剂盒、MDA（丙二醛）试剂盒、GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶）试剂盒及超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒羟、自由基（·OH）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；其他的试剂均为国产分析纯。

1.2实验主要用到的仪器

Epoch酶标仪（美国BioTek）；TGL-16M型高速台式冷冻离心机（购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DFY-250A高速组织粉碎机；MSE型分析电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH）能力的测定

1.3.3清除超氧自由基（·O2-）能力的测定

取0.1 mL不同浓度的样品溶液加到25℃预热的4.5 mL 0.1 M的Tris-HCl（pH 8.2）中，再加入0.3 mL 3mM邻苯三酚溶液，25℃反应3 min，320 nm下测定吸光度。对照组以同等体积的蒸馏水代替样品溶液，以同等体积的HCl代替邻苯三酚做空白调零。每组浓度设置3个平行孔，测量后取平均值。按照如下公式计算清除率：

清除率%=（A对照-A样品）/A对照×100

1.3.4体内抗氧化活性能力的测定

选用成年健康清洁级雄性小鼠60只，随机分为阳性对照组、空白组、模型组，清溪花鳖肽高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组测10只。空白组皮下注射生理盐水0.1 mL/（10 g·d），其余各组小鼠皮下注射D-半乳糖200 mg/（kg·d），以建立衰老模型。同时，清溪花鳖肽低剂量组、中剂量组、高剂量组以100、200、400 mg/（kg·d）的剂量灌胃给予清溪花鳖肽；阳性对照组以100 mg/（kg·d）的剂量灌胃给予Vc阳性药；造模组和空白组用等体积的生理盐水灌胃。每日注射或者灌胃一次并连续6周处理。小鼠末次注射、灌胃后禁食12 h，眼球取血，脱颈椎处死。血液3000 rpm离心20 min，吸取上层血浆，-20℃存放备用。取小鼠肝脏，称重，研磨。肝脏组织和血清中的MDA含量通过硫代巴比妥酸比色法测定，SOD活力采用氮蓝四唑光化还原法测定，CAT活力采用钼酸铵法测定，GSHPx活力采用比色法测定，具体操作步骤按照试剂盒说明书方法进行。

1.4数据处理

采用SPSS 19.0处理数据，结果以平均值±标准差（mean±SD）表示。显著性差异采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）检验，P值小于0.05为显著差异，P值小于0.01为极显著差异。

2实验结果

2.1清溪花鳖肽的体外抗氧化能力

抗氧化肽的体外抗氧化活性可以通过研究抗氧化肽对自由基的清除能力来评价，如对DPPH自由基、·OH自由基和·O2-等自由基清除能力。如图1所示，清溪花鳖肽对DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基的清除能力较好，且呈现出一定的剂量依赖性，IC50值分别为2.45 mg/mL，4.36 mg/mL和6.95 mg/mL。

2.2体内抗氧化活性

2.2.1清溪花鳖肽对衰老小鼠肝脏组织的作用

与体外测定方法相比，利用动物模型进行体内试验能更准确的评价活性肽的生物学功能。衰老与活性氧有关，增强抗氧化酶活性可以抗衰老。体内抗氧化酶有过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）[6]。丙二醛（MDA）是体内脂质过氧化的产物，也是评价衰老的指标之一[7]。由图2可知，模型组的MDA含量极显著高于空白组，同时SOD、CAT和GSH-Px活性极显著降低，说明造模成功。清溪花鳖肽组与模型组相比，低剂量组中的MDA含量及SOD、GSH-Px活力没有显著变化，CAT活力显著升高；中和高剂量组中的CAT、SOD和GSH-Px活力都显著升高，MDA含量显著降低。说明中、高剂量的清溪花鳖肽对小鼠肝脏氧化有较强的抑制作用。

2.2.2清溪花鳖肽对衰老小鼠血清的影响

如图3所示，模型组小鼠与空白组相比，其血清中CAT、SOD和GSH-Px活力显著降低，MDA含量显著升高，说明造模成功。清溪花鳖肽中、高剂量组中的SOD、CAT和GSH-Px活力与模型组相比都显著升高，MDA含量显著降低，与阳性组无显著差异。说明中、高剂量的清溪花鳖肽可以说增加小鼠体内抗氧化酶的活力，使机体更好的清除过量自由基。

3结论

衰老是机体组织结构发生退化和生理功能丧失的过程。根据自由基理论，机体内过量的活性氧对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤是诱发衰老的关键。在细胞的正常状态下，常见的活性氧，如超氧阴离子、氧原子衍生物及羟基自由基等的生成和清除处于动态平衡中。一方面它们会持续生成，另一方面机体会将它们及时清除。然而，当人体机体衰老时，机体清除活性氧的能力就会下降，这就导致了未能及时被清除的活性氧的积累，进而它们会对细胞的组织会产生损伤。因此，从来源上来说，补充外源性抗氧化剂或增强机体内源性抗氧化酶活性就可以及时清除体内累积的过量的活性氧，从而达到延缓衰老的目的。已经有许多研究表明，一些天然活性物质可以清除自由基，以达到延缓衰老、减少与衰老相关疾病的发生。也正是基于前人发现的衰老与氧化压力之间的密切关系，我们设计了本项目。理论的依据主要是基于之前的研究发现抗氧化肽可以通过激活抗氧化信号通路、清除过量的自由基以及提高机体内抗氧化酶的活性来延缓衰老。

本项目观察了清溪花鳖肽体内外的抗氧化活性，发现清溪花鳖肽对体外DPPH、·OH和·O2-自由基有较强的清除作用，其IC50分别为2.45 mg/ml，4.36 mg/ml和6.95 mg/mL。清溪花鳖肽中、高剂量组与模型组相比，小鼠血浆和肝脏中MDA含量、SOD、CAT和GSH-Px活力都有显著性差异。说明清溪花鳖肽具有较强的体外内抗氧化作用，可能通过抑制脂质过氧化反应，减少MDA的生成并且在其代谢过程中激活多种内源性抗氧化酶类，清除体内的自由基。

【参考文献】

[1] Ivanova D G，Yankova T M.The free radical theory of aging in search of a strategy for increasing life span[J]Folia Medica，2013，55（1）：33-41.

[2]顾龙建，程学勋，吴巨贤，等.抗氧化肽来源及其抗氧化活性测定研究进展[J].广州化工，2021，49（14）：25-27.

[3]朴美子，王懋存，王晓东.中华真地鳖酶解短肽的抗氧化作用[J].食品科学，2013，34（5）：242-245.

[4]田裕心，彭亚博，姚昱锟，等.响应面优化鲍鱼内脏抗氧化肽制备工艺及其活性[J].食品工业，2019，40（4）：110-115.

[5]刘嵘，胡晓川，卞筱泓.清溪花鳖肽对尿酸钠所致大鼠痛风性关节炎的作用[J].药物生物技术，2021，28（6）：579-584.

[6]周玉枝，闫明亮，高丽，等.衰老动物模型的研究及其在抗衰老药物活性筛选中的应用[J].中草药，2017，48（6）：1061-1071.

[7] Cui JJ，Yuan JF，Zhang ZQ.Anti-oxidation activity of the crude polysaccharides isolated from Polygonum Cillinerve（Nakai）Ohwi in immunosuppressed mice[J].Journal of Ethnopharmacology，2010，132（2）：512-517.

【作者簡介】

万晓君，女，1988年出生，主管药师，硕士，研究方向为药学。通讯作者：许激扬，男，1956年出生，教授，硕士研究生导师，研究方向为微生物与生化药学。

（本稿审读：王震红）