赵 炜,刘金明,杨磊婷,沈 铭,张静露

血管新生是指新毛细血管的生长,是骨修复再生的关键,新生血管可将氧和营养物质运输到活跃的成骨微环境并清除代谢废物,并可作为募集炎症细胞、软骨细胞和成骨细胞前体细胞等功能细胞的重要途径[1-2]。血管化骨再生近年来成为骨再生相关领域研究热点,促进血管化骨再生在种植术区骨修复再生中的研究亦受到密切关注[3-6]。随着人均期望寿命提升,老年人群在种植修复治疗患者中占比明显提升。而老年患者存在衰老相关的骨组织愈合延迟和骨再生功能退化风险[7-8],有研究发现成血管功能退化亦为老年患者骨再生功能退化的重要因素[9],因此,血管化骨再生在促进老年患者早期骨结合的形成过程中可能发挥重要作用。近年来有研究发现间充质干细胞来源的外泌体能够改善细胞的衰老表型[10-11],低氧预处理的间充质干细胞外泌体具有改善病理性血管功能的作用[12]。人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cell,hAMSC)具有较高干性、低免疫原性、获得量理想及获取过程无侵入性操作等特征,是一种具有较好应用前景的组织工程种子细胞[13]。基于以上,本研究通过建立人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)衰老模型探讨低氧预处理人羊膜间充质干细胞来源的外泌体(hAMSC-derived exosomes, hAMSC-exos)能否改善HUVEC衰老功能。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

α-MEM培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco,美国);ECM培养基(Sciencell,美国);青霉素-链霉素溶液(Gibco,美国);胶原酶D、中性蛋白酶(罗氏,美国);衰老相关β-半乳糖苷酶活性染色试剂盒(碧云天,中国);transwell小室(8 μm)、Matrigel基质胶(BD Biosciences,美国);人血小板裂解液(Helios,德国);0.45 μm及0.22 μm微生物过滤筛(Merck Millipore,德国);细胞裂解与蛋白抽提试剂盒(Thermo Fisher,美国);P16一抗、γH2AX一抗(Abcam,美国);β-actin一抗、P53一抗(Santa cruz,美国);HRP标记二抗(Bioworld,美国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天,中国);D-半乳糖(D-gal,Sigma-Aldrich,美国);ECL化学发光试剂盒(新赛美,中国)。

细胞培养箱(Thermo Fisher,美国);蛋白电泳系统、凝胶成像系统(Bio-Rad,美国);高速离心机(Thermo Fisher,美国);真空超高速离心机(Beckman Coulter,美国);透射电子显微镜(Tecnai G2 Spirit TEM,Zeiss,Oberkochen,德国)、Zetaview纳米粒子跟踪分析仪(Particle Metrix,德国)。

1.2 细胞来源及细胞培养

本实验伦理审批号:No.PJ2021-0390001(南京医科大学)。

1.2.1 HUVEC提取及培养 取得健康足月产妇分娩后废弃的胎盘脐静脉,实验室内消化脐静脉腔,离心后提取原代HUVEC并扩增。原代HUVEC于无菌培养箱中生长,培养环境稳定,CO2含量5%,温度为37 ℃,用于其培养的ECM完全培养基含有5%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素及1%内皮生长因子。P2～P4代HUVEC被用于细胞实验。

1.2.2 hAMSC提取及培养 取得健康足月产妇分娩后废弃的胎盘。在超净台中用含有5%人血小板裂解液和1%青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基充分漂洗。剥离羊膜层,剪成约4.0 mm×4.0 mm的薄片,在中性蛋白酶(2.4 U/mL)溶液中充分消化10 min后,立刻用胶原酶D(1 mg/mL)在37 ℃培养箱中消化2.5～3.0 h,过滤后取得hAMSC细胞悬液,常规低速离心后取得细胞,用含5%人血小板裂解液的α-MEM完全培养基培养细胞,24～48 h后首次换液并观察细胞状态。

1.2.3 常氧(Nor)和低氧预处理(Hy)hAMSC-exos的制备流程 将第二代hAMSC接种于含2 μg/mL肝素、5%人血小板裂解液、1%青霉素-链霉素溶液的α-MEM完全培养基,分别在20%(Nor)和2%(Hy)的氧含量条件下生长至80%汇合度,弃去皿内原有培养基,以无菌PBS冲洗3次,加入适当体积无血清混合培养基(50% DMEM高糖基础培养基+50% α-MEM基础培养基)继续培养,24 h后分别收集上清液。3 000 ×g常温离心以沉淀细胞碎片,分别收集上清液。高速离心机预冷至4 ℃,按以下流程离心:300 ×g,10 min;2 000 ×g,10 min;10 000 ×g,30 min。将离心后的上清液经0.22 μm微生物过滤筛滤入超高速离心管,于4 ℃真空超高速离心机以120 000 ×g离心2 h。弃去离心后的上清液,以适量无菌PBS洗涤离心管底以充分重悬外泌体。吸取适量外泌体悬液,BCA蛋白浓度测定试剂盒按562 nm吸光度测定外泌体浓度,其余储存备用。

1.3 hAMSC-exos的表征

1.3.1 hAMSC-exos电镜形态拍摄 铜涂层网格上加入提取的hAMSC-exos悬液,放置5 min后加入2%乙酸双氧铀染色后室温干燥10 min,调整透射电子显微镜(TEM)为120 kV,拍摄网格中的外囊泡。

1.3.2 hAMSC-exos的纳米粒子追踪分析(nanoparticles tracking analysis, NTA) 取100 μg hAMSC-exos,无菌PBS稀释至1 mL;用纳米粒子跟踪分析仪评估hAMSC-exos的尺寸分布,基于布朗运动和扩散系数,自动跟踪粒子并确定其大小。设定仪器为(23.75±0.50)℃,25 s/帧(FPS),持续60 s。

1.4 衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性检测

HUVEC的SA-β-Gal活性通过SA-β-Gal活性染色试剂盒检测,将HUVEC以5×104个/孔细胞密度接种到6孔培养板中。按照制造商的要求进行SA-β-Gal活性染色,显微镜40倍物镜下收集图像并计数。

1.5 HUVEC衰老诱导

P2～P4代HUVEC接种于六孔板中,贴壁后更换含20 g/L D-gal的ECM完全培养基,孵育48 h后更换常规ECM完全培养基继续培养48 h以诱导亚急性衰老,用SA-β-Gal活性染色验证诱导效果。

1.6 HUVEC衰老挽救实验

P2～P4代HUVEC接种于6 孔板使其贴壁,对照组不作处理,D-gal处理组、D-gal处理+Nor hAMSC-exos孵育组和D-gal处理+Hy hAMSC-exos孵育组HUVEC用20 g/L D-gal孵育48 h以诱导衰老,随后分别更换培养体系为常规ECM完全培养基以及含有终质量浓度为200 ng/μL Nor hAMSC-exos或Hy hAMSC-exos的ECM完全培养基,继续培养48 h后进行SA-β-Gal活性染色以评估衰老挽救效果。

采用蛋白质免疫印迹法进一步验证Hy hAMSC-exos改善HUVEC衰老的效果。使用细胞裂解与蛋白抽提试剂盒提取对照组、D-gal处理组和D-gal处理+Hy hAMSC-exos孵育组总蛋白,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,随后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭该膜2 h后用针对P53、P16、γH2AX、β-actin的一抗在4 ℃冰箱孵育过夜,TBST洗涤后二抗室温孵育2 h。使用超敏ECL化学发光试剂使印迹可视化。

1.7 transwell小室迁移实验

将对照组、D-gal处理组、D-gal处理+Hy hAMSC-exos孵育组HUVEC经消化、离心,分别以基础培养基重悬并计数,各取30 000个细胞于EP管中,补齐细胞悬液至200 μL,于小室下室加入600 μL含5%胎牛血清的培养体系,EP管中细胞悬液吹打混匀后加入上室。在培养箱中继续培养16 h后取出小室,吸去小室内培养体系,甲醇结晶紫固定1 h。晾干后于显微镜40倍物镜下每组随机选取3个视野拍照并计数。

1.8 HUVEC成管实验

将液化Matrigel基质胶按50 μL/孔加入96孔板,37 ℃孵育30 min使其凝固。消化离心对照组、D-gal处理组、D-gal处理+Hy hAMSC-exos孵育组HUVEC,用ECM完全培养基重悬并计数,每组取含15 000个HUVEC细胞的悬液,配成100 μL体系打在基质胶上,3.5 h后显微镜40倍物镜下每组取3个随机视野拍照,用Image J软件分析成管长度。

1.9 划痕实验

对照组、D-gal处理组、D-gal处理+Hy hAMSC-exos孵育组HUVEC经消化、离心后分别接种于提前画线标记的12孔板,用ECM完全培养基培养至近100%汇合度。枪头垂直板底,垂直标记线方向在板底单层细胞划出两条合适宽度的划痕,随后更换培养体系为含2%胎牛血清的ECM完全培养基,继续培养16 h。显微镜40倍物镜下收集每组划痕后0 h和16 h同一视野5张照片,用Image J软件分析各组迁移率。

1.10 统计学方法

统计分析绘图使用GraphPad Prism 9.0 版本软件进行,两组间统计分析使用t检验,多组间统计分析使用Turkey’s检验联合one-way ANOVA。所有实验均重复3次,P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 hAMSC-exos的表征

在TEM下,hAMSC-exos呈现出经典的杯形或球形形态(图1A);根据NTA,MSC-sEV的粒径分布曲线在55～200 nm之间,符合外泌体的直径分布规律(图1B)。

A:TEM;B:NTA

2.2 Hy hAMSC-exos较明显改善HUVEC衰老的衰老表型

SA-β-Gal活性染色结果表明,较Nor hAMSC-exos,Hy hAMSC-exos孵育能够更明显地降低衰老HUVEC中SA-β-Gal活性染色阳性细胞率(图2A、B)。图2C显示,因衰老上升的P53、P16和γH2AX蛋白水平在Hy hAMSC-exos孵育后被显著逆转。进一步验证了Hy hAMSC-exos具有较好地缓解HUVEC衰老的作用。

A:SA-β-Gal活性染色显微镜下观察;B:SA-β-Gal活性染色阳性细胞率;**:P<0.01,*:P<0.05;C:衰老标志蛋白的免疫印迹实验

2.3 Hy hAMSC-exos部分改善HUVEC的衰老相关功能退化

图3～5显示,衰老HUVEC的小管生成长度减少,同时小室迁移率和划痕迁移率降低,体现出明显的功能退化;而加入Hy hAMSC-exos孵育,则显著逆转了这一趋势。

A:显微镜下观察;B:成管总长度;***:P<0.001,**:P<0.01

A:显微镜下观察;B:细胞迁移率;***:P<0.001,**:P<0.01

A:显微镜下观察;B:划痕迁移率;**:P<0.001,*:P<0.01

3 讨 论

随着人口老年化,临床种植治疗老年患者占比显著增加,而老年患者骨量不足、骨修复再生功能退化是种植临床需要解决的问题。老年机体各系统呈现整体性的功能性衰老退化[7],其中骨骼微环境中血管内皮细胞的衰老是骨再生和重塑障碍的重要因素[14]。近年来有研究发现间充质干细胞来源的外泌体能够改善细胞的衰老表型[10-11],其中乏氧诱导的间充质干细胞外泌体具有改善病理性血管功能的作用[15]。基于以上,我们认为低氧预处理的干细胞外泌体能够改善衰老内皮细胞功能,进而促进血管化骨再生。首先在体外建立了相关细胞模型并开展研究,结果发现:①D-gal可诱导HUVEC亚急性衰老从而建立HUVEC衰老细胞模型;②Hy hAMSC-exos可降低衰老HUVEC中相关标志物的表达;③Hy hAMSC-exos可改善衰老HUVEC成血管功能的减弱。

骨组织是一种高度血管化的组织,其发育、成熟、重塑和再生高度依赖于血管功能。骨形成和骨折愈合的过程中,血管化不仅为间充质干细胞迁移提供了通道,也是为代谢活跃的骨组织提供氧气和营养物质以及清除代谢废物的必要途径[16]。血管化骨再生在骨组织工程中越来越受到重视,以改善因外伤、手术或生理性骨修复不足等造成的骨组织丧失的治疗[17]。外泌体对血管生成的作用近年来已有研究,Atienzar-Aroca等发现,视网膜色素上皮细胞来源的外泌体能够促进血管生成而引发致盲性眼疾病[18];Lu等[19]的研究显示,骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以在体内和体外促进血管生成,从而增强血管化成骨的效果;亦有研究发现某些外泌体对血管生成具有抑制性作用,Dong等[20]曾经通过外泌体向内皮细胞传递抗血管生成肽抑制视网膜血管生成。目前的研究大多针对外泌体对生理状态下的血管内皮细胞的影响,而对病理(如衰老)状态下的血管内皮细胞的作用缺乏关注。在我们的研究中,使用D-gal刺激正常的HUVEC以诱导其亚急性衰老状态,建立衰老HUVEC细胞模型;然后使用常氧和低氧预处理的人羊膜间充质干细胞来源的外泌体作用于衰老HUVEC,结果显示Hy hAMSC-exos可更有效地改善HUVEC衰老及其成血管功能的退化。

衰老的特征是机体各系统整体性的功能退化[7]。研究显示,老年患者骨再生表现出明显的延迟甚至受损[8]。衰老成骨细胞的遗传和表观遗传变化,以及衰老相关的微环境改变导致的对分化因子敏感性降低是老年患者成骨功能退化的重要原因[21-22]。近年来有研究进行了改善衰老相关的骨再生障碍的尝试。如通过TERT基因(端粒逆转录酶)的过表达使老化的骨髓干细胞“重端粒化”,以及改善衰老相关分泌表型产生的不良炎症微环境,达到缓解衰老、改善干性特征、增强骨再生的效果[23-24]。这些研究在改善衰老相关的成骨障碍方面取得了一定效果。而间充质干细胞来源的外泌体具备较为理想的再生潜力,同时具有低免疫原性、低消除率和高融合率等诸多优点,近年来在抗衰老研究领域受到关注[25]。有研究发现,骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够缓解成骨细胞的衰老并刺激其成骨活性[26];Zuo等[27]的一项研究中,骨髓间充质干细胞来源的外泌体具有缓解辐照导致的骨髓干细胞的衰老和成骨功能退化的作用。对于在骨再生初始阶段中发挥重要作用的血管内皮细胞的衰老尚未见研究[28]。我们通过构建HUVEC衰老模型来模拟老年患者颌骨种植术区血管内皮衰老的微环境,通过Hy hAMSC-exos作用于衰老的HUVEC,结果显示其显著改善了衰老HUVEC相关衰老表型及功能退化。

本研究初步揭示了低氧预处理的人羊膜间充质干细胞外泌体具有逆转HUVEC衰老的作用,而此过程中涉及的具体分子机制尚不清楚。已有相关研究表明,外泌体可以直接结合细胞膜表面并与细胞膜融合或通过内吞作用被内化,从而将包裹在其中的蛋白、核酸和脂质传递至目标细胞[29]。近来Lei等的一项研究表示,新生儿脐带干细胞来源的外泌体通过转移增殖细胞抗原相关的mRNA来缓解人骨髓间充质干细胞的衰老[30],这为外泌体通过传递核酸成分缓解靶细胞衰老的策略提供了一定的理论依据。基于该研究,我们后续将进一步明确Hy hAMSC-exos是否通过某些发挥关键作用的mRNA改善HUVEC衰老过程。