高宇 徐畅 刘强

中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192

在全球女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率和病死率均居第4 位[1]。2020 年，全球有60.4 万宫颈癌新发病例和34.2 万宫颈癌死亡病例；中国约有11.0 万例宫颈癌患者，其中包括5.9 万死亡病例[2]。目前，宫颈癌的治疗方法包括手术、化疗和放疗等[3]。宫颈癌Ⅰ B3～ⅣB 期患者均需行放疗，然而约30%接受放疗的患者会出现肿瘤复发[4]。因此，研究影响宫颈癌细胞在放疗后DNA损伤修复的分子机制对提高宫颈癌的放疗效果具有重要意义。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是由原癌基因c-erbB1 编码的Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶受体（TKR），其由1 210 个氨基酸构成，相对分子质量约为170 000。EGFR 分为3个部分：与配体结合的细胞外结构域、跨膜结构域和含有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域。EGFR被认为与多种癌症的预后有关，如头颈癌、肺癌、食道癌和胃癌[5]。有研究报道，EGFR 信号通路在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要作用，其过表达或扩增在宫颈癌中发挥调控细胞辐射抗性的作用[6]。

核转录因子E2 相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，NRF2）在保护细胞免受氧化、亲电等多种环境因素威胁，维持暴露在辐射或药物下的细胞内的氧化还原动态平衡方面具有重要作用。有研究结果证明，肿瘤细胞中NRF2 的过表达通常与辐射和化学耐药性有关[7]。有文献报道，在黑色素瘤细胞中，NRF2 可以促进EGFR 的激活，而在口腔癌细胞中EGFR 可以促进NRF2 的激活[8-9]。但在宫颈癌细胞中，关于EGFR 和NRF2 在辐射诱导的DNA 损伤修复中的关系目前鲜见报道。本研究旨在探讨辐射后的宫颈癌HeLa 细胞中EGFR 和NRF2 对DNA 损伤修复的影响及其二者之间的相互关系，为指导宫颈癌的放疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 EGFR 与宫颈癌患者生存率的关系

通过cBioPortal（http://www.cbioportal.org）对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中宫颈癌患者的数据进行分析。

1.2 试剂与仪器

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、β-Tubulin抗体、Lamin B 抗体、NRF2 抗体、辣根过氧化物酶偶联亲和山羊抗小鼠和兔免疫球蛋白G、Cy3 标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G 购于美国Proteintech公司；EGFR 抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司；p-共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶（ataxia telangiectasia mutated gene and Rad3-related kinase，ATR）（Thr1989）抗体购于美国GeneTex 公司；p-细胞周期检查点激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）（Ser345）和血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司；磷酸化组蛋白H2A变异体（phosphorylated histone 2A variant，γ-H2AX）（Ser139）抗体购自英国Abcam 公司；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购于苏州吉玛基因股份有限公司；RNAimax转染试剂、NE-PER 细胞核和细胞质提取试剂购自美国Thermo Fisher 公司；胎牛血清（FBS）购于日本HAKATA 公司；DMEM液体培养基购于美国HyClone 公司；4%组织固定液、牛血清白蛋白（BSA）、Opti MEM 培养基购自美国Gibco 公司；PBS缓冲液、Loading buffer、Tween-20、碘化丙锭（PI）溶液多聚甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0.25%）购自北京索莱宝科技有限公司；快速RNA提取试剂盒购于湖南艾科瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒购自北京宝日医生物技术公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片剂购于北京Vectorlabs 公司；三乙醇胺缓冲液（tris buffered saline，TBS）为天津市放射医学与分子核医学重点实验室自制；微型离心管（eppendorf，EP）购于天津本生健康科技公司；低温台式离心机（5424R 型）购于德国Eppendorf 公司；DMI3000B倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司；37℃ 恒温培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；CFXConnect实时定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司；Gammacell®40 Exactor137Cs γ 射线照射源购自加拿大Best Theratronics 公司。

1.3 细胞的培养、照射处理和分组

人宫颈癌HeLa 细胞由中国国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。人宫颈癌HeLa 细胞在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，置于5% CO2、37℃的培养箱培养。每隔48 h 传代1 次，细胞消化液为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（0.25%）。

细胞经137Cs γ 射线照射源进行单次8 Gy 照射，吸收剂量率为0.875 Gy/min。

将人宫颈癌HeLa 细胞按2 种处理方式分组：（1）采用siRNA 敲降HeLa 细胞中的EGFR，采用137Cs γ 射线照射源照射细胞。将HeLa 细胞分为对照组（HeLa siCtrl）、敲降EGFR 组（HeLa siEGFR）、照射组（HeLa siCtrl+8 Gy）、敲降EGFR+照射组（HeLa siEGFR+8 Gy）。采用免疫荧光实验检测细胞中γ-H2AX foci的数量；采用流式细胞术检测细胞周期；采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测NRF2 下游靶基因；采用核质分离实验分离胞质、胞核蛋白；采用蛋白质免疫印迹法检测NRF2、EGFR、HO-1 和ATR 在Thr1989 位点的磷酸化水平，CHK1 在Ser345 位点的磷酸化水平。（2）采用siRNA 敲降HeLa 细胞中的NRF2，采用137Cs γ 射线照射源照射细胞。将HeLa 细胞分为对照组（HeLa siCtrl）、敲降NRF2 组（HeLa siNRF2）、照射组（HeLa siCtrl+8 Gy）、敲降NRF2+照射组（HeLa siNRF2+8 Gy）。采用免疫荧光实验检测细胞中γ-H2AX foci 的数量。

1.4 siRNA 的转染

EGFR 的siRNA 序列为：5′-GGAGAUAAGU GAUGGAGAUTT-3′

NRF2 的siRNA 序列为：5′-GGCAUUUCACU AAACACAATT-3′

转染前1 d，将处于对数生长期的HeLa 细胞按5×105个/孔接种于6 孔板中，待细胞密度为50%左右时，更换为1 ml 新的含10%胎牛血清的DMEM培养基。取4 μl siRNA 和4 μl RNAimax 转染试剂分别稀释于200 μl Opti MEM 培养基中，将2 种溶液混合，使用移液器缓慢吹打混匀，室温放置5 min。将混合液加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，缓慢晃动培养皿使其分布均匀。培养基在37℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育8 h，加入1 ml 含10%胎牛血清的DMEM 培养基（不含抗生素），继续培养至24 h，收集细胞用于后续实验。

1.5 核质分离实验

照射后6 h，收集HeLa 细胞至EP 管，使用预冷的PBS 洗2 次，吸干PBS，加入含蛋白酶抑制剂的细胞质提取试剂Ⅰ（CER Ⅰ），涡旋EP 管15 s，使细胞颗粒完全悬浮。将EP 管放在冰上孵育10 min，向EP 管中加入细胞质提取试剂Ⅱ（CER Ⅱ），涡旋EP 管5 s；再将EP 管在冰上孵育1 min，涡旋5 s。将EP 管在离心机（16 000×g，4℃）中离心5 min，立即将上清液（细胞质提取液）转移到另一个干净的EP 管中，加入1/3 体积的4×Loading buffer，混匀，100℃裂解变性10 min。将产生的含核的不溶性（球团）部分悬浮于含有蛋白酶抑制剂的核提取试剂（NER）中，将涡旋调至最高，涡旋15 s。将样本放在冰上孵育，每10 min 涡旋15 s，共涡旋5 次。将样本在离心机中以最大速度（16 000×g）离心10 s，立即将上清液（核提取液）转移到一个干净的预冷EP 管中，加入1/3 体积的4×Loading buffer，于100℃下进行10 min 裂解变性。

1.6 细胞免疫荧光实验

将对数生长期的HeLa 细胞按1×105个/孔接种到12 孔板中的载玻片上，待细胞完全贴壁后进行8 Gy 照射，分别在照射6、12、24 h 后取出载玻片，用PBS 洗3 次，每次5 min；加入4%组织固定液，室温固定20 min，之后再用PBS 洗3 次，每次5 min；使用预冷的0.3% 聚乙二醇辛基苯基醚（Trinton X-100）室温处理载玻片30 min，PBS洗3 次，每次5 min。使用1% BSA（PBS 配置）4℃封闭载玻片2 h，在γ-H2AX 抗体中4℃孵育12 h，用PBS 洗3 次，每次5 min。用Cy3 标记的山羊抗鼠和兔免疫球蛋白G 室温避光孵育载玻片1 h；用PBS 洗3 次，每次5 min。用含4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片，将载玻片转移至倒置荧光显微镜下拍照并记录细胞中γ-H2AX foci的数量。

1.7 蛋白质免疫印迹实验

采用Western blot 法检测EGFR、NRF2、ATR、p-ATR、CHK1、p-CHK1 的蛋白表达水平。分别提取各组HeLa 细胞的总蛋白，检测蛋白浓度，取30 μg 蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDSPAGE）电泳分离，转膜，封闭2 h，加入p-ATR（Thr1989）（1∶1 000）、p-CHK1（Ser345）（1∶1 000）、EGFR（1∶1 000）、NRF2（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）、β-Tubulin（1∶5 000）、Lamin B（1∶5 000）一抗稀释液，4℃ 孵育过夜，使用TBST（tris buffered saline with Tween-20）洗涤30 min，加入二抗（HRP偶联亲和山羊抗小鼠和兔免疫球蛋白G）（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST 洗涤30 min 后显影。

1.8 RT-PCR

采用快速RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒将RNA 逆转录为互补DNA（cDNA），检测EGFR、HO-1 基因的表达，同时检测GAPDH基因的表达，作为内参。扩增条件：95℃ 激活10 min；95℃ 变性 15 s、60℃ 退火1 min，循环35次。应用RT-PCR 仪分析荧光强度，采用2−∆∆Ct法对数据进行分析。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下。

GAPDH 引物序列：

正向5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′

反向5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′

EGFR 引物序列：

正向5′-AGGCACGAGTAACAAGCTCAC-3′

反向5′-ATGAGGACATAACCAGCCACC-3′

HO-1 引物序列：

正向 5′-CTTCTTCACCTTCCCCAACA-3′

反向 5′-AGCTCCTGCAACTCCTCAAA-3′

1.9 细胞周期的检测

将对数生长期的HeLa 细胞按5×105个/孔接种于6 孔板中。待细胞完全贴壁后，对细胞进行8 Gy照射，6 h 后收集细胞，用PBS 清洗2 次，去除PBS后用预冷的70%乙醇4℃固定细胞2 h，4℃离心（2 000 r/min，离心半径为10 cm，5 min）去除乙醇，使用预冷的PBS 清洗细胞1 次，去除PBS，使用碘化丙啶（PI）缓冲液重悬细胞，37℃避光染色30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.10 统计学方法

应用IBM SPSS Statistics 22.0 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以±s 表示，组间比较采用两独立样本t检验（方差齐）。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR 与宫颈癌患者生存率的关系

宫颈癌患者中存在5%的EGFR 基因突变，其中扩增型突变是主要的突变类型（图1A）。与未发生EGFR 基因突变的宫颈癌患者相比，突变患者的生存期更短（图1B）。以上结果提示EGFR 对宫颈癌患者的生存率至关重要，可作为宫颈癌的潜在治疗靶标。

图1 宫颈癌患者的EGFR 遗传改变及与生存率的关系 A 为宫颈癌患者EGFR 基因突变的统计图；B 为 EGFR 基因突变与宫颈癌患者生存率相关性的统计图。EGFR 为表皮生长因子受体Figure 1 Genetic alterations of epidermal growth factor receptor in cervical cancer patients and its relationship with survival rate

2.2 EGFR、NRF2 对HeLa 细胞DNA 损伤修复能力的影响

细胞免疫荧光实验结果显示，在8 Gy 照射后6、12、24 h，HeLa siEGFR 组细胞中γ-H2AX foci的数量均多于HeLa siCtrl 组[（94.00±1.00）% 对（89.67±2.03）%、（72.33±1.76）% 对（60.00±1.73）%、（43.00±2.31）% 对（26.33±1.20）%]，且差异均有统计学意义（均P<0.05）（图2A）。8 Gy 照射后6、12、24 h，HeLa siNRF2 组细胞中γ-H2AX foci 的数量均多于HeLa siCtrl组[（96.67±0.88）%对（89.67±2.03）%、（77.33±1.20）% 对（60.00±1.73）%、（54.33±2.19）% 对（26.33±1.20）%]，且差异均有统计学意义（均P<0.05）（图2B）。上述实验结果表明，敲降EGFR 或者NRF2 均可降低人宫颈癌HeLa 细胞的DNA 损伤修复能力。

图2 EGFR、NRF2 对人宫颈癌HeLa 细胞DNA 损伤修复的影响 A 为HeLa siCtrl 和HeLa siEGFR 组细胞经8 Gy 照射后不同时间γ-H2AX foci 的形成图及比较；B 为HeLa siCtrl 和HeLa siNRF2 组细胞经8 Gy 照射后不同时间γ-H2AX foci 的形成图及比较。a 表示与HeLa siCtrl 组细胞比较，差异均有统计学意义（t=3.919、4.919、6.402，均P<0.05）；b 表示与HeLa siCtrl 组细胞比较，差异均有统计学意义（t=3.166、4.989、11.220，均P<0.05）。EGFR 为表皮生长因子受体；NRF2 为核转录因子E2 相关因子2；DNA 为脱氧核糖核酸；HeLa siCtrl 为对照组；HeLa siEGFR 为小干扰RNA 敲降EGFR 组；γ-H2AX 为磷酸化组蛋白H2A 变异体；HeLa siNRF2 为小干扰RNA 敲降NRF2 组；DAPI 为4，6-二脒基-2-苯基吲哚Figure 2 Effect of epidermal growth factor receptor and nuclear factor-E2-related factor 2 on DNA damage and repair of cervical cancer HeLa cells

2.3 EGFR 对NRF2 功能的影响

Western blot 实验结果显示，HeLa 细胞经8 Gy照射后，EGFR 和NRF2 蛋白水平均升高，在6 h时达到最大值（图3A），提示在HeLa 细胞中EGFR和NRF2 可能在调控DNA 的损伤修复过程中发挥了重要作用。RT-qPCR 实验结果显示，正常条件下敲降EGFR 对HO-1 表达无明显影响，且差异无统计学意义（t=0.925，P>0.05）。与HeLa siCtrl 组细胞比较，HeLa siEGFR+8 Gy 的HO-1 表达下降66.66%（1.35±0.10 对0.45±0.02），且差异有统计学意义（P<0.05），辐射可以导致NRF2 靶基因HO-1的表达水平升高（图3B）。流式细胞术结果显示，HeLa siCtrl、HeLa siEGFR、HeLa siCtrl+8 Gy、HeLa siEGFR+8 Gy 组细胞的G2 周期细胞比例分别是（18.83±0.44）%、（17.07±0.94）%、（44.90±2.81）%、（29.53±2.10）%，与HeLa siCtrl+8 Gy 组细胞相比，HeLa siEGFR+8 Gy 组的HeLa 细胞G2/M 期阻滞明显受损，且差异有统计学意义（P<0.05）（图3C）。Western blot 实验结果显示，敲降EGFR 显著抑制了辐射导致的CHK1 的磷酸化和HO-1 蛋白水平的升高（图3D）。以上实验结果表明，电离辐射可以引起NRF2 和EGFR 蛋白水平升高、NRF2 下游的DNA 损伤响应信号通路和靶蛋白的激活以及G2/M期阻滞。敲降EGFR 会抑制电离辐射导致的NRF2下游的ATR-CHK1 信号通路的活化和HO-1 的激活，并且G2/M 期阻滞受损。

图3 敲降EGFR 对HeLa 细胞中NRF2 下游信号通路及靶蛋白的影响 A 为Western blot 实验检测HeLa 细胞8 Gy 照射后2、4、6 h时EGFR 和NRF2 蛋白的表达水平；B 为RT-qPCR 实验检测HeLa 细胞敲降EGFR 后HO-1 基因的相对表达变化；C 为细胞周期实验检测EGFR 对辐射引起的HeLa 细胞G2/M 周期阻滞的影响；D 为Western bolt 实验检测EGFR 对CHK1-ATR 信号通路及HO-1 的影响。a 表示与HeLa siCtrl+8 Gy 组细胞比较，差异有统计学意义（t=8.782，P<0.05）；b 表示与HeLa siCtrl+8 Gy 组细胞比较，差异有统计学意义（t=4.384，P<0.05）。EGFR 为表皮生长因子受体；NRF2 为核转录因子E2 相关因子2；RT-qPCR 为 实时荧光定量聚合酶链式反应；HO-1 为血红素氧合酶1；CHK1 为细胞周期检查点激酶1；ATR 为共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3 相关激酶；siCtrl 为对照组；β-Tubulin 为β-微管蛋白；siEGFR 为小干扰RNA 敲降EGFR 组；mRNA 为信使核糖核酸；DNA 为脱氧核糖核酸Figure 3 Effects of epidermal growth factor receptor knockdown on nuclear factor-E2-related factor 2 downstream signaling pathway and target protein in HeLa cells

2.4 敲降EGFR 对NRF2 核定位的影响

NRF2 进入细胞核中才能发挥辐射抵抗的作用，NRF2 的核定位对于响应电离辐射至关重要，我们采用核质分离实验来检测EGFR 对NRF2 核定位的影响，结果如图4 所示，敲降EGFR 会导致NRF2 蛋白水平下降；辐射使在细胞核内定位的NRF2 蛋白增加，而敲降EGFR 会减少辐射导致的NRF2 蛋白在细胞核中的定位，说明EGFR 很可能通过促进NRF2 的核定位来调控辐射诱导的DNA损伤修复。

图4 照射和未照射条件下敲降EGFR 后HeLa 细胞中EGFR、NRF2 蛋白在细胞质和细胞核中表达水平的比较 EGFR 为表皮生长因子受体；NRF2 为核转录因子E2 相关因子2；siCtrl为对照组；siEGFR 为小干扰RNA 敲降EGFR 组；Lamin B 为核纤层蛋白B；GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶Figure 4 Comparison of epidermal growth factor receptor and nuclear factor-E2-related factor 2 protein expression levels in cytoplasm and nucleus of HeLa cells after knocking down epidermal growth factor receptor under irradiation and nonirradiation conditions

3 讨论

放疗是宫颈癌的主要治疗方法之一，一半以上的宫颈癌患者需要接受放疗[10]。近年来，随着放疗技术的发展，以三维体外照射及三维腔内照射为主的放疗新技术被广泛应用，宫颈癌患者的治疗取得了良好的效果，但辐射抗性仍是导致肿瘤复发或持续的主要因素，因此抑制肿瘤细胞DNA 的损伤修复仍非常必要[11]。有研究报道，大约70%的宫颈癌患者中存在EGFR 过表达的情况，并且EGFR过表达与疾病特异性生存期（DSS）的缩短相关[12]。本研究对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中宫颈癌患者的数据进行分析，发现EGFR 突变的宫颈癌患者比例仅为5%，远低于之前的研究结果[12]，但疾病特异性生存期（DSS）的缩短确实与EGFR 过表达相关，所以EGFR 的过表达可能更多发生在mRNA 或者蛋白水平。本研究的结果表明，照射后HeLa 细胞中EGFR 蛋白的表达水平明显升高。为了进一步评估EGFR 对宫颈癌细胞DNA 损伤修复的影响，我们通过免疫荧光实验观察敲降EGFR后受照HeLa 细胞中的DNA 损伤情况，结果表明敲降EGFR 会降低HeLa 细胞的DNA 损伤修复能力。

辐射通过直接导致DNA 双链断裂或者产生活性氧间接对DNA 造成损伤。为了减轻对遗传物质的伤害，细胞会启动DNA 损伤反应（DDR）促进对损伤DNA 的修复，使细胞周期进程停滞，为修复受损的DNA 提供足够的时间[13-14]。通过Western blot、RT-qPCR 和流式细胞术实验，我们发现敲降EGFR 后，受照射HeLa 细胞中ATR-CHK1 信号通路的激活受到抑制，HO-1 的表达水平降低、细胞G2/M 期阻滞受损。这提示EGFR 可能通过影响NRF2 的功能发挥辐射抵抗作用。

NRF2 是基础亮氨酸拉链家族的成员，通过抗氧化反应元件（ARE）激活细胞内编码抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶的基因转录。一般情况下，Kelch 样ECH 关联蛋白1（Keap1）通过泛素介导的蛋白酶体降解负向调节NRF2 活性[15]。当细胞暴露于氧化、亲电或外来生物刺激时，NRF2 会摆脱Kelch 样ECH 关联蛋白1（Keap1）的控制，转位到细胞核中，与Maf 家族的一个小蛋白形成异源二聚体，调控含有抗氧化反应元件（ARE）的下游基因的转录[5,15]。有研究报道，NRF2 的细胞保护功能也可导致对肿瘤细胞的保护，从而促进肿瘤细胞的转化、生长、转移和化疗耐药的形成[16]。有研究结果表明，NRF2 通过促进ATR 激活和G2/M 期阻滞来保持基因组的完整性，DNA 发生损伤时，ATR调控的一个主要应答过程是细胞周期阻滞。ATR可通过自身活化并磷酸化蛋白激酶CHK1 引起细胞周期阻滞[17]。通过核质分离实验结果，我们发现敲降EGFR 明显减少了辐射诱导的细胞核内NRF2蛋白水平的增加。通过免疫荧光实验结果，我们发现敲降NRF2 后，HeLa 细胞的DNA 损伤修复能力降低，表明敲降EGFR 会导致NRF2 下游信号通路受阻，即电离辐射诱导HeLa 细胞DNA 损伤修复有赖于EGFR 的表达。但目前我们还不确定EGFR是如何调控NRF2 在胞内的分布，在今后的研究中，将进一步探索EGFR 对NRF2 作用的具体机制。

综上所述，本研究采用人宫颈癌HeLa 细胞，从细胞及分子水平证实电离辐射后EGFR 可促进NRF2 蛋白向细胞核内转移，从而激活NRF2 下游的ATR/CHK1 信号通路及靶基因HO-1 的表达，提高细胞的DNA 损伤修复能力。因此，我们发现了EGFR 在人宫颈癌HeLa 细胞辐射抗性中发挥作用的一种可能机制，为靶向EGFR 在宫颈癌临床治疗中的应用提供了分子基础及理论依据。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明高宇负责实验的实施、论文的撰写与修订；徐畅负责方法的建立、数据的分析、论文的审阅；刘强负责研究命题的设计、论文的修订