占坤，杨正利，徐子怡，赖章凤，李军，陈罗君，周四喜，李明玺，甘玉迪*

1. 江西农业大学农学院，江西 南昌 330045；2. 修水县茶叶科学研究所，江西 九江 332400；3. 江西省宁红集团有限公司，江西 九江 332400

宁红茶是江西省茶叶“四绿一红”中的“一红”，也是我国最早的传统工夫红茶之一，具有滋味甜醇，香高持久，叶底红亮等品质特征，受到众多消费者青睐[1]。在红茶加工过程中，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC1.10.3.1）是参与茶叶变色的关键酶[2]，能够催化多酚类物质生成茶黄素类物质，对红茶品质形成起着重要作用[3-4]。茶树品种是决定茶叶品质重要因素之一，茶树良种是茶叶优质、高产的基础[5]。宁红茶主产区九江市修水县，适制茶树品种有国家级良种宁州群体种和宁州2 号，以及修水县茶叶科学研究所宁州群体种品种园突变的无性系繁殖株系大叶龙[6]等，分析适制宁红茶茶树品种PPO 酶学特性对茶叶品质提升具有实际生产意义。

PPO 是由多基因控制的蛋白酶，不同品种间PPO 存在较高遗传多样性，有大量单核苷酸多态性（SNP）位点，品种间含有差异突变位点，可能导致品种间PPO 活性和酶学性质存在较大差异[7-8]。已有研究表明，不同葡萄品种PPO 对邻苯二酚亲和力存在差异性[9]，不同品种马铃薯PPO 最适温度、pH 等都有差异[10]，不同品种苹果mPPO 表现出显著不同的特性[11]。不同茶树品种PPO 性质已有诸多研究，如福鼎大白茶和金观音PPO 活性显著高于英红9 号、槠叶齐[12]；春季采摘期，福鼎大白茶PPO 活性呈现显著上升趋势，白叶1号PPO 活性偏低，黄金芽、紫鹃、龙井43 的PPO 活性变化趋势一致[13]。

PPO 在细胞中以可溶态（sPPO）和膜结合态（mPPO）两种形式存在[14]。sPPO 和mPPO的合成和运输是一个非常复杂的过程，PPO 进入叶绿体前会在细胞质中合成PPO 前体肽，PPO 前体肽先依赖ATP 导入叶绿体基质，再通过基质肽酶将其进一步加工，然后依靠光进入到管腔形成成熟的PPO，即sPPO，而前体肽则被转运肽转运至内囊体膜上形成mPPO[15-17]。植物体内sPPO 直接参与酚类物质化学反应，mPPO 要在细胞膜结构被破坏后才能被释放出来进行反应[18]。sPPO 和mPPO酶学性质差异较大，两者对不同底物、不同抑制剂等都有较大差异。宁红茶风味独特，但目前对宁红茶品质形成机理相关研究较少，适制宁红茶茶树品种的sPPO 和mPPO 酶学活性比较也鲜见报道。本研究拟通过对适制宁红茶茶树品种的sPPO 和mPPO 进行酶学性质分析，确定高PPO 酶活性宁红茶茶树品种，助力高茶黄素宁红茶生产。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁州群体种、宁州2 号、大叶龙茶树品种鲜叶于2022 年7 月19 日上午8 时采摘自九江市修水茶叶生态科技园种质资源圃，宁州群体种树龄60 a、大叶龙树龄20 a、宁州2 号树龄40 a，鲜叶采摘标准均为一芽二叶，采摘后立即用液氮冷冻并置于-80℃的冰箱冷藏。

醋酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、抗坏血酸、氯化钠、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苯甲基磺酰氟、Triton X-100、Tris-HCl、硫酸铵、叔丁醇、邻苯二酚、绿原酸、愈创木酚、没食子酸、咖啡酸、冰醋酸等均为分析纯，购自于北京索莱宝科技有限公司。

SpectraMax-M2 酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司；Centrifuge 5920 R 冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；DK-98-IIA 型恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；pH400 台式pH 计，安莱立思仪器科技（上海）有限公司。

1.2 mPPO 和sPPO 粗酶提取

取茶树鲜叶10 g，按照料液比1∶2 加入含有2%（W/V）PVPP、30 mmol·L-1抗坏血酸、1 mmol·L-1EDTA 的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.80），冰浴充分研磨，所得浆液在4 ℃浸提12 h，随后在4 ℃、8 000 r·min-1离心30 min。收集的上清液即为sPPO 粗酶液。

PPO 粗酶提取参考刘芳等[19]方法，用去离子水冲洗提取的sPPO 滤渣5 次，然后将其溶解于含有0.25% Triton X-100 的50 mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液（pH 6.8）中；将混合物搅拌2 min，进行10 min 超声处理，在4 ℃下培养1 h，并在8 000 r·min-1下离心15 min。4 ℃环境下静置30 min，然后35 ℃水浴锅保温15 min，在25 ℃、8 000 r·min-1下离心15 min。透明上清液即为mPPO 粗酶液。

1.3 酶含量与酶活性的测定

1.3.1 酶含量的测定

使用Bradford 蛋白质浓度测定试剂盒，根据BSA 蛋白标样制作标准曲线，并计算样品中的蛋白质浓度。利用BSA 标样制作的标准曲线方程为Y=3.04X＋0.51（R2=0.999）。

1.3.2 酶活性的测定

反应混合物由0.15 mL 0.20 mol·L-1邻苯二酚、1.25 mL 0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.80）和0.10 mL 酶溶液组成。在37 ℃下静置5 min，1 个单位的PPO 酶活性（U）被定义为在 420 nm 波长条件下的吸光度每分钟0.001 单位的变化[20]。

1.4 不同条件下适制宁红茶茶树品种酶学性质比较试验

1.4.1 最适温度测定

按照1.3.2 章节方法，其他条件不变，将反应温度分别调整为25、35、45、55、65、75、85 ℃，测定mPPO 和sPPO 酶活性。

1.4.2 最适pH 值测定

按照1.3.2 章节方法，其他条件不变，分别在浓度为 50 mmol·L-1的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 分别为3.50、4.00、4.50、5.00、5.50），磷酸盐缓冲液（pH 分别为6.00、6.50、7.00、7.50），Tris-HCl 缓冲液（pH 8.00 和pH 8.50）条件下，测定sPPO 和mPPO 酶活性。

1.4.3 酶动力学参数的测定

分别配制浓度为 6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mmol·L-1和200.00 mmol·L-1的邻苯二酚溶液，测定不同底物浓度下酶的活性， 绘制米氏曲线， 并参照双倒数（Lineweaver-Burk）作图，得出直线Y1=ax＋b，其中纵截距值为1/Vmax，斜率为Km/Vmax，即a/b[21]。

1.4.4 底物特异性比较试验

分别配制0.20 mol·L-1的邻苯二酚、绿原酸、愈创木酚、没食子酸和咖啡酸5 种底物溶液与提取酶液反应，将底物为邻苯二酚时测定的活力大小设置为100%，并按照1.3.2 章节方法测定sPPO 和mPPO 酶活性。

1.4.5 不同抑制剂条件下酶学性质比较试验

分别配制 5.00、50.00、100.00 mmol·L-1的抗坏血酸、EDTA、草酸、柠檬酸、碘化钾、氯化钠，将1.15 mL 0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.80）和0.10 mL mPPO 或sPPO 与0.15 mL 0.20 mol·L-1邻苯二酚及0.10 mL 抑制剂混合，按照1.3.2 章节方法测定sPPO 和mPPO 酶活性。

1.4.6 mPPO 和sPPO 热失活动力学分析试验

在不同温度（45、55、65 ℃和75 ℃）和不同时间（10、20、30、40、50 min 和60 min）下，将0.10 mL mPPO 或sPPO 装入试管中进行处理。待样品温度恢复室温后，通过公式1～6 测定残余活性[22]。

式中，A0是初始多酚氧化酶活性；At是时间t时的剩余多酚氧化酶活性；t1/2为多酚氧化酶的失活半衰期（min）；k为热失活速率（min-1）；D是酶降低至10%活性所需要的时间（min）；ZT值表示D值对温度的敏感性，即D值变化一个对数时对应的温度变化；T值为热力学温度（K）；Ea表示多酚氧化酶的反应活化能（kJ·mol-1）；R是理想气体常数（8.314 J·mol-1·K-1）。

1.5 统计分析

采用Origin 8.0 绘图，SPSS 20.0 进行统计学分析，数据以平均值±标准差（±SD）表示。采用邓肯法进行多重差异比较，当P＜0.05 认为有统计学显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同茶树品种PPO 比活力比较

如表1 所示，以邻苯二酚为底物，不同茶树品种mPPO 比活力均高于sPPO 比活力。不同品种间 mPPO 比活力相差较大，大叶龙mPPO 比活力最高，分别约为宁州2 号和宁州群体种mPPO 比活力的2.02 倍和2.15 倍。不同品种间sPPO 比活力相差较小，大叶龙sPPO比活力最高，为(262.71±12.59)U·mg-1，宁州2 号 sPPO比活力最低，为(112.57 ±14.01)U·mg-1。

表1 不同茶树品种mPPO 与sPPO 比活力比较Table 1 Comparison of the specific vitalities of mPPO and sPPO in different tea cultivars

2.2 不同茶树品种PPO 最适温度比较

如图1 所示，不同茶树品种mPPO 和sPPO酶活性随温度的升高呈现先升后降的变化趋势。mPPO 最适反应温度在40～60 ℃，宁州2号和大叶龙的 mPPO 最适反应温度均为55 ℃，宁州群体种 mPPO 最适反应温度为45 ℃。75 ℃时，宁州群体种和宁州2 号mPPO均出现小峰。sPPO 最适反应温度在30～50 ℃。宁州2 号和宁州群体种sPPO 酶活性变化趋势基本一致，最适反应温度为 35 ℃，大叶龙sPPO 最适反应温度为45 ℃。

图1 不同茶树品种在不同温度下mPPO 和sPPO 酶活性的比较Fig. 1 Comparison of mPPO and sPPO enzyme activities of different tea cultivars under different temperatures

2.3 不同茶树品种PPO 最适pH 比较

mPPO 与sPPO 在pH 3.00～9.00 范围内酶活变化分别如图2 所示。mPPO 酶活性随pH升高，先上升后下降，再上升后下降，呈现出双峰型，最适pH 在5.00～8.00。宁州群体种和大叶龙mPPO 最适pH 均为6.00，宁州2 号mPPO 最适pH 为5.50，大叶龙和宁州2 号mPPO 在pH 7.00 出现第二个峰值，宁州群体种mPPO 在pH 7.50 出现第二个峰值。sPPO酶活性随pH 升高先上升再下降，呈现单峰型，sPPO 最适pH 值在7.00～8.50，大叶龙和宁州2 号sPPO 最适pH 值为7.50，宁州群体种最适pH 值为8.00。

图2 不同茶树品种在不同pH 下mPPO 和sPPO 酶活性的比较Fig. 2 Comparison of mPPO and sPPO enzyme activities of different tea cultivars under different pH

2.4 不同茶树品种PPO 的底物特异性

如图3 所示，各茶树品种sPPO 和mPPO对二羟基酚亲和力较高，其中，对邻苯二酚亲和力最强，宁州2 号mPPO 对邻苯二酚亲和力最强。以咖啡酸为底物，宁州2 号、宁州群体种和大叶龙的mPPO 酶活性相对较高。以绿原酸和没食子酸为底物，mPPO 和sPPO 的酶活性比以咖啡酸为底物低。各茶树品种sPPO 和mPPO 对一羟基酚愈创木酚亲和力较弱。

图3 不同茶树品种在不同底物下酶活性的比较Fig. 3 Comparison of enzyme activities in different tea cultivars under different substrates

2.5 抑制剂对不同茶树品种PPO 活性的影响

如表2 所示，在不同抑制剂作用下PPO活性差异显著，在抗坏血酸和草酸作用下PPO活性差异较显著。抗坏血酸对sPPO 抑制效果最好，尤其是宁州群体种sPPO，半抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）值为(2.98±0.13)。螯合剂类型的抑制剂，EDTA、草酸、柠檬酸对酶活性的抑制效果有较大的差别，EDTA 对大叶龙sPPO 抑制效果最弱，IC50值为(25.74±0.05)，而EDTA 对适制宁红茶茶树品种mPPO 均有活化作用。草酸、柠檬酸对各品种sPPO 与mPPO 酶活性有不同程度的抑制作用。卤化物抑制剂碘化钾、氯化钠对sPPO 与mPPO 活性均无抑制作用。

表2 抑制剂对不同茶树品种酶活力的抑制参数比较Table 2 Comparison of inhibition parameters of inhibitors on enzyme activity in different tea cultivars

2.6 不同茶树品种的PPO 动力学分析

图4、图5 分别为以邻苯二酚为底物，mPPO 与sPPO 活性倒数与底物浓度倒数的线性回归结果，宁州群体种mPPO 和sPPO 米氏方程分别为Y=1 613.24X+15.95、Y=952.55X+18.90，大叶龙mPPO 和sPPO 米氏方程分别为Y=6 188.95X+27.62、Y=4 396.45X+20.88，宁州2 号mPPO 和sPPO 米氏方程分别为Y=376.09X+10.87、Y=2 161.55X+20.45。表3 为mPPO 与sPPO 的酶动力学参数，Km数值反应酶和底物亲和能力大小，Km越小亲和力越强，不同品种mPPO 与sPPO 的Km差别较大，宁州2 号mPPO 的Km最小为34.60 mmol·L-1，大叶龙mPPO 的Km最大为224.04 mmol·L-1，宁州2 号mPPO 与邻苯二酚结合能力最强。宁州2 号mPPO 的Vmax最大为9.20×10-2ΔA·min-1，大叶龙mPPO 的Vmax最小为3.62×10-2ΔA·min-1。宁州2 号mPPO 的Vmax/Km值最大为265.89，催化效率最高。

表3 不同茶树品种中sPPO 与mPPO 的酶动力学参数Table 3 Enzyme kinetic parameters of sPPO and mPPO in different tea cultivars

图4 不同茶树品种的mPPO 活性的米氏曲线（A）和Lineweaver-Burk（B）图Fig. 4 Michael's curves (A) and Lineweaver-Burk plots (B) of mPPO activity of different tea cultivars

图5 不同茶树品种的sPPO 活性的米氏曲线（A）和Lineweaver-Burk（B）图Fig. 5 Michael's curves (A) and Lineweaver-Burk plots (B) of sPPO activity in different tea cultivars

2.7 不同茶树品种PPO 的热失活动力学比较

不同茶树品种sPPO 与mPPO 热失活的一级动力学模型参数如表4 所示，45～75 ℃各品种sPPO 与mPPO 的失活速率常数k、半衰期t(1/2)存在显著差异。sPPO 与mPPO 的k值随着温度升高而增大，表明sPPO 和mPPO 随温度升高失活速率越快，sPPO 和mPPO 高温条件下不耐热。半衰期t(1/2)、D值是酶稳定性的重要参数[23]，75 ℃时，sPPO 的k值均比mPPO大，sPPO 的半衰期t(1/2)、D值均比mPPO 小，mPPO 比sPPO 耐热性更好。大叶龙mPPO 失活速率常数k最低为(41.88±3.16)×10-3min-1，宁州群体种sPPO 失活速率常数k最高，比大叶龙 mPPO 失活速率常数k高 2 倍，为(92.42±9.31)×10-3min-1。大叶龙mPPO 半衰期t(1/2)=(17.68±4.61)min，D=(58.73±5.31)min 均为最高， 而宁州群体种 sPPO 半衰期t(1/2)=(8.96±3.66)min，D=(29.76±2.15)min 均为最低，表明大叶龙mPPO 耐热性最好，宁州群体种sPPO 耐热性最差。

表4 不同茶树品种sPPO 与mPPO 失活的一级动力学模型参数Table 4 First-order kinetic model of sPPO and mPPO inactivation in different tea cultivars

Ea值反映酶构象结构稳定性，ZT值表明酶对温度的敏感性[24-25]。不同品种 sPPO 的Ea值在59.24～131.86 kJ·mol-1，mPPO 的Ea值在39.35～79.38 kJ·mol-1，sPPO 比mPPO 热稳定性更强，宁州群体种sPPO 的Ea值最高为131.86 kJ·mol-1，大叶龙mPPO 的Ea值最低为39.35 kJ·mol-1，宁州群体种sPPO 热敏感性最强，大叶龙mPPO 热敏感性最差。mPPO 的ZT值在 38.93～61.50 ℃，sPPO 的ZT值在19.26～47.57 ℃，sPPO 比mPPO 对温度敏感性更强，大叶龙mPPO 的ZT值为61.50 ℃，表明大叶龙mPPO 对温度敏感性最弱，宁州群体种sPPO 对温度敏感性最强。

3 讨论

茶叶加工过程中，PPO 酶活性是决定茶树品种适制性的重要指标，PPO 酶活性高有助于高茶黄素红茶品质的形成[26]。刘仲华等[27]研究表明，不同茶树品种同工酶存在差异性，PPO 酶活性也存在差异。本研究中适制宁红茶的茶树品种间PPO 酶活性也存在差异，以邻苯二酚为底物，mPPO 比活力均高于sPPO 比活力，这与Zaini 等[28]的研究结果一致。大叶龙 mPPO比活力最高，为(542.59 ±25.13)U·mg-1，宁州2 号sPPO 比活力最低，为(112.57±14.01)U·mg-1，表明大叶龙mPPO可作为宁红茶加工较适制酶源。

PPO 有mPPO 和sPPO 两种存在形式，在细胞内所处的位置不同，参与反应所需条件也不相同。不同茶树品种PPO 理化性质差异较大，对影响酶活性主要因素的敏感程度也存在差异。本研究中3 个茶树品种的sPPO 和mPPO最适反应温度在30～60 ℃，宁州2 号和大叶龙mPPO 最适反应温度最高，均为55 ℃，与孙慕芳等[29]研究信阳群体种 PPO 最适温度为50～55 ℃一致。宁州2 号和宁州群体种sPPO最适反应温度最低，为35 ℃，与伍梦瑶等[30]研究勐库大叶种PPO 最适温度37 ℃接近。因此适制宁红茶的茶树品种间PPO 最适温度存在差异。PPO 酶活性中心、底物离子强度、酶的来源等因素导致PPO 最适pH 值存在差异[31]，本研究结果显示，mPPO 最适pH 在5.00～8.00，有2 个峰，pH 为5.50 和7.00 时宁州2 号mPPO活性较高；sPPO 最适pH 值在7.00～8.50，有1 个峰，pH 为8.00 时宁州群体种sPPO 活性最高，与Wang 等[32]结果一致，可能由于品种间存在不同的同工酶，也可能由于PPO 酶活性中心不同[19]；茶树品种间各PPO 与不同底物反应结果显示，mPPO 比sPPO 与底物亲和能力强，且mPPO 和sPPO 对二羟基酚有较强亲和力，对一羟基酚、三羟基、多羟基酚亲和力较弱，宁州2 号mPPO 对邻苯二酚亲和力最强，催化效率最高，PPO 对底物的亲和能力与底物结构以及自身同工酶构成有关[31,33]；不同抑制剂对PPO 酶活性抑制机理和作用效果不同，抗坏血酸主要通过其还原力对PPO 产生抑制作用，能够将中间产物邻醌还原成相应的酸，也可将Cu2+还原为Cu+，而且它的抑制作用和浓度有关[34]。本研究中抗坏血酸对宁州群体种sPPO 抑制效果最好，卤化物抑制剂对sPPO 与mPPO 活性均无抑制作用。EDTA 可通过耦合铜离子抑制PPO 活性，EDTA 对大叶龙sPPO 抑制效果最弱，而EDTA 对各品种mPPO 均有活化作用，与Liu 等[11]研究结果一致。有效通过底物或抑制剂调控PPO 酶活性对宁红茶品质提升具有十分重要的作用。适制宁红茶的茶树品种间sPPO 和mPPO 的热失活遵循一级反应动力学规律，mPPO 比sPPO 耐热性更好，sPPO 比mPPO 热稳定性更强，sPPO比mPPO 对温度的敏感性更强，与Zhou 等[35]和 Han 等[36]研究结果一致，这可能是由于mPPO 是sPPO 的前体蛋白，在mPPO 成熟过程中前导肽被多肽酶裂解所导致的。大叶龙mPPO 耐热性最好，热敏感性最差，对温度敏感性最弱，而宁州群体种sPPO 耐热性最差，热敏感性最强，对温度敏感性最强。

综上所述，在不同反应条件下，适制宁红茶的3 个茶树品种mPPO 和sPPO 存在一定差异，大叶龙茶树品种mPPO 比活力最高，耐热性最好，可为宁红茶生产加工提供合适的酶源。本研究结果为进一步得到高茶黄素宁红茶奠定一定理论基础。