赵 妍，陈 娟，袁 倩，王子卉，朱小辉，郝征红，毕文慧*，任长博，孟维国

（1.山东农业工程学院食品科学与工程学院，山东济南 250100；2.山东省十里香芝麻制品股份有限公司，山东 滨州 251900）

酯酶是一类能催化酯键断裂和形成的酶，在脂肪分解和酯类物质合成方面具有重要作用，广泛应用于果酒酿造、果蔬制品风味改良等精深加工领域[1]。现有酯酶主要来源于微生物，自然界中能产生酯酶的微生物资源十分丰富，如青霉、镰孢霉、曲霉、酵母菌、梨头霉等真菌，及假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等细菌。另外，少数放线菌也能分泌酯酶[2-3]。其中，细菌因能产生种类多、产量大、纯度高的酯酶，已成为工业酯酶的主要来源。酯酶根据其最适反应温度可分为常温酯酶和嗜热酯酶。在果蔬精深加工过程中，嗜热酯酶比常温酯酶更具优势，其可以在高温下完成催化，且在高盐、有机溶剂存在的反应环境中具有更高的稳定性，因此在加工过程中应用嗜热酯酶可有效防止生产污染，保证产品品质的稳定[4]。嗜热酯酶具有极高的行业应用需求，但许多已知嗜热酯酶存在产量低、热稳定性差等问题，不能满足实际生产需求。目前能够应用于工业生产并且能够量产的酯酶种类较少，因此还需要从环境中不断筛选高活性、高稳定性、产酶量大的候选工业酯酶，以满足果蔬精深加工等食品行业的需求[5]。

芝麻废弃物、畜禽粪便等资源不及时处理会造成环境污染，如果以其为肥源进行堆肥，能够起到资源节约和环境保护的重要作用。以芝麻废弃物、畜禽粪便为原料进行堆肥，其高温期温度可达50～70 ℃，为嗜热微生物营造了一个优良生境，且这些原料中油脂含量偏高，更易于诱导产酯酶微生物的生长[6]，并有望筛选到高活性产嗜热酯酶的菌株。本试验采用鉴别平板筛选法从堆肥样品中筛选产嗜热酯酶微生物，并对筛选菌株的发酵特性进行了研究，以期为工业酯酶生产菌种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PCR 引物、DNA marker、PCR 预混液、DNA loading buffer、琼脂糖、SDS、CTAB，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR Clean-Up kit，Promega 生物技术有限公司；GenGreen 核酸染料，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；革兰氏染色液，北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉、LB 肉汤、可溶性淀粉培养基、糖发酵基础肉汤、明胶培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基、Kovacs 氏靛基质试剂、胰蛋白胨水培养基、V-P 试验试剂盒、甲基红试验试剂盒、硝酸盐还原试剂盒、硝酸盐肉汤，青岛海博生物技术有限公司；石蕊，天津光复试剂有限公司；三丁酸甘油酯、乙二胺四乙酸二钠盐、NaCl 等，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 培养基

筛选培养基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、10 mL 三丁酸甘油酯、琼脂15.0 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

产酶培养液：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、5 mL 三丁酸甘油酯、蒸馏水100 0mL、pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.3 仪器与设备

TC-S Gene Max 基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；Nanodrop One 超微量核酸蛋白质测定仪，赛默飞世尔科技公司；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统，伯乐生命医学产品有限公司；DMi8 倒置生物显微镜，徕卡显微系统有限公司；TGL-16 台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 产嗜热酯酶微生物的初筛与纯化

将芝麻废弃物堆肥高温期样品接种于LB 肉汤中，于55 ℃振荡培养3 d。将活化后的菌悬液梯度稀释后，涂布于含1%三丁酸甘油酯的LB 平板上，于55 ℃下培养24 h。从初筛平板上挑取不同形态、具有明显水解圈的单菌落进行分离纯化，直至获得纯培养物[7]。

1.4.2 高活性产嗜热酯酶微生物的筛选

分别测量纯化后各单菌落的水解圈直径和菌落直径，计算水解圈直径与菌落直径的比值（hydrolysis circle，HC），选取HC 值最大的菌株再次纯化并进行菌种鉴定[8]。

1.4.3 产嗜热酯酶细菌的鉴定试验

（1）形态学鉴定

将筛选到的菌株点接于筛选培养基平板，55 ℃下培养24 h 后观察菌落形态。同时进行革兰氏染色，观察菌体颜色、形态[9]。

（2）生理生化鉴定

通过淀粉水解试验、糖发酵试验、明胶液化试验、柠檬酸盐试验、靛基质试验、V-P 试验、甲基红试验、硝酸盐试验、石蕊试验检测筛选菌株的生理生化特性[10-11]。

（3）分子生物学鉴定

采用CTAB 法提取菌株基因组DNA，挑取一环纯培养物于1 mL 无菌水中，混匀后在4℃、14 000 r/min 条件下离心1 min。将沉淀转移到含有1.35 mL 裂解液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA-Na+、100 mmol/L磷酸钠、1.5 mol/L NaCl、1% CTAB，pH 8.0）和150 μL 20% SDS的离心管中，轻轻混匀，放置在65 ℃恒温水浴锅中水浴2 h，每20 min 反转混匀，水浴结束后在4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，取上清液。在上清液中加入900 μL 异丙醇沉淀1 h，在4 ℃、14 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清液。在含有沉淀的离心管中加入700 μL 75%乙醇，在4 ℃、14 000 r/min、离心2 min，弃上清液。取100 μL无菌水溶解DNA。测定DNA 浓度并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测[12]。使用通用引物27F-5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R-5′-ACGGY TACCTTG TTACG ACTT-3′，采用冯广达等[13]PCR 反应体系和运行程序进行16S rRNA 基因扩增。按照PCR Clean-Up kit 的操作程序回收扩增产物，将PCR 产物送至上海铂尚生物技术公司测序。测序结果运用DNAman 进行序列拼接，BLAST 进行序列比对，并将序列提交至Genbank 数据库（Genbank No.MZ203594），利用MEGA 5.0 软件构建系统发育树[14]。

1.4.4 菌株最适培养条件

（1）最适培养温度的测定

将菌株GRJ 2 接种至LB 培养液中，分别放置于50、55、60、65、70、75 ℃下培养16 h，测定OD600nm以确定最适生长温度。

（2）最适培养pH 值的测定

将菌株GRJ 2 接种至LB 培养液中，调整培养液初始pH 为4、5、6、7、8、9，在最适培养温度下培养16 h，测定OD600nm以确定最适生长pH。

1.4.5 菌株生长曲线的测定

将菌株GRJ 2 以1%接种量接种至LB 培养液中，在最适温度、pH 条件下培养，每隔2 h 取样并测定OD600nm，绘制生长曲线。

1.4.6 产酶曲线检测

（1）分批培养

将菌株GRJ2 以1%接种量接种至产酶培养液中，55℃下连续培养，分别在0、4、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28 h 时取发酵液，离心制备粗酶液。

（2）连续培养

方法同分批培养，在培养至14 h 时，补加10%新鲜产酶培养液（5 倍浓缩）[15]。

（3）酯酶活性测定

采用对硝基苯酚法，以对硝基苯酚丁酸酯为底物测定酶活[16]。标准曲线回归方程y=4.16x-0.0038（R2=0.9992）。1 个酶活力单位定义为1 min 释放1 μmol 对硝基苯酚所需要的酶量。

1.5 数据处理

使用SPSS 23.0 软件进行数据差异显著性分析，P＜0.05 说明数据间差异显著；使用Origin 2021 软件绘制柱状图和点线图。

2 结果与分析

2.1 高活性产嗜热酯酶微生物的筛选

产嗜热酯酶微生物具有分解三丁酸甘油酯的能力，在含有三丁酸甘油酯的培养基中生长会在菌落周围形成明显的透明水解圈，水解圈直径与菌落直径之间的比值越大，代表微生物的活力越大[17]。通过筛选试验发现5 株菌可见明显透明水解圈，其中GRJ 2 菌株HC 值为3.0，其HC 值最大，说明酯解能力最强（表1）。

表1 产嗜热酯酶细菌菌落HC 值Table 1 HC value of colony of thermophilic esterase producing bacteria

2.2 产嗜热酯酶微生物鉴定结果

2.2.1 形态及生理生化鉴定结果

菌株GRJ 2 在平板上形成的单菌落呈乳白色，边缘整齐，表面光滑、湿润，在菌落周围可见明显的透明水解圈，符合产嗜热酯酶微生物在三丁酸甘油酯选择培养基上生长的典型菌落形态特征[17]（图1A）；革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状（图1B）。

图1 菌株平板菌落特征（A）及革兰氏染色结果（B）Fig.1 Properties of bacterial colony (A) and gram staining results (B)

根据《伯杰氏系统细菌学手册》，菌株GRJ 2 生理生化结果（见表2）符合芽孢杆菌属特性[11]。

表2 筛选菌株生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification of isolated strain

2.2.2 分子生物学鉴定结果

以菌株GRJ 2 基因组DNA 为模板，扩增16S rRNA基因，PCR 扩增结果显示菌株GRJ 2 获得约1 500 bp 的单一条带，可用于菌株测序鉴定（图2A）。GRJ 2 菌株测序结果经序列拼接获得一段1 450 bp 的基因片段，Blast比对后发现该基因片段与嗜热淀粉芽孢杆菌（C.thermoamylovorans）的16S rRNA 基因相似度为99.73%。结合其形态及生理生化鉴定结果，初步鉴定菌株GRJ 2为嗜热淀粉芽孢杆菌（C.thermoamylovorans），其系统发育树见图2B。

图2 分子生物学鉴定结果Fig.2 Identification results of molecular biological

2.3 菌株发酵特性

2.3.1 菌株最适发酵条件

由图3A（见下页）可知，温度对菌株GRJ 2 生长的影响较为明显，菌株GRJ 2 在50～65 ℃的温度范围内均能生长；但当温度高于70 ℃时，生长明显受抑制。在同样培养时长内，55 ℃条件下菌悬液吸光度最高，说明菌株浓度最高、生长最快，由此确定菌株的最适生长温度为55 ℃。菌株可以在pH 5～9 范围内生长，对酸、碱性环境都有一定耐受能力，但是在同样培养条件下，pH 为7 时菌株生长最快，因此菌株GRJ 2 最适生长pH 值为7。

图3 菌株最适培养温度（A）及pH（B）Fig.3 Optimum incubation temperature (A) and pH (B) of strain

2.3.2 最适发酵条件下菌株生长及产酯酶特性

生长曲线可以反应细菌在发酵期间生长变化趋势，从而确定种子液制备时间[18]，图4（见下页）为在最适培养温度和pH 条件下（55 ℃、pH 7）菌株GRJ 2 的生长曲线与产酶曲线。发酵前0～4 h 为菌株生长延迟期，细菌增殖速度较为缓慢；4～14 h 菌株快速增殖，处于对数生长期；培养16 h 后，在不添加新鲜培养液的情况下进入衰亡期，细胞数量逐渐下降。该菌株培养10 h（OD600nm=0.52）即达到适宜细胞浓度，可作为种子液用于发酵生产（图4A）。

图4 菌株GRJ 2 生长曲线（A）与产酶曲线（B）Fig.4 Growth curve (A) and enzyme production curve (B) of GRJ 2

产酶曲线表征发酵过程中酯酶分泌情况，用于确定产物收获期[19]。在分批培养12 h 后开始大量产酶，至第18 h 酶活达最高3.87 U/mL，相较来源于Acinetobacterjohnsonii菌株的酯酶活性更高[20]。嗜热酯酶最佳收获时间为16～22 h；在培养至14 h 时补加新鲜培养液，可以将产酶期延长4 h，该菌株适合于连续培养生产嗜热酯酶（图4B）。

3 小结

采用传统的分离培养技术进行产酯酶微生物筛选，可以获得更加稳定、高产的菌株，利用菌株发酵生产酯酶，实现量产并应用于工业生产的可行性较强[21]。本研究从堆肥高温期样品中分离、筛选得到产嗜热酯酶菌株GRJ 2，经形态学、生理生化、分子生物学鉴定，该菌株为嗜热淀粉芽孢杆菌（C.thermoamylovorans）。该菌株可以在50～65 ℃条件下生长，最适生长温度为55 ℃；可耐受酸、碱性环境，最适生长pH 为7。该菌株作为种子液只需活化10 h 即可达到较高菌种浓度，培养16 h 后即可收获酯酶，并且在连续培养条件下可以显著延长酯酶收获时间。本菌株可以经诱变育种进一步提升其产酶量及产酶活性，也可改造为底盘微生物用于工业化嗜热酯酶生产，以满足果蔬精深加工等食品领域不断增长的嗜热酯酶需求。