薛 莱,邱红梅,黄 波,罗 雯,张昌兰,孟杉杉,杨 东,杨志堂,蒋青松

(1.江油市人民医院 临床药学科,四川 江油 621700;2.重庆医科大学药理教研室,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆 400016;3.遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室,贵州 遵义 563003)

糖尿病是严重危害人类健康的慢性疾病之一,其发生与胰岛素分泌及利用缺陷紧密相关,常伴随糖脂水平失衡。肝脏是调节糖脂代谢的主要器官。有研究发现,糖尿病是肝损伤的一种独立危险因素[1]。糖尿病时血液中长期血糖升高和血脂紊乱可损伤肝脏结构和功能,其引起的肝损伤也被称为糖尿病肝病,初期的主要特征为脂肪在肝细胞聚集,又称为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)。通常情况下,NAFLD可能并发炎症,从脂肪变性进展为脂肪性肝炎,即非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),而后继续进展为肝纤维化(肝硬化),最终出现肝衰竭[2]。尽管针对糖尿病肝病已进行了较多的研究,但其发病机制目前仍未完全阐明,亦无特异性治疗靶点和针对性药物。

柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.],性味甘、酸、寒,归肝、脾、胃经,柚皮苷是其主要活性成分之一。柚皮素(naringenin,NAR)为柚皮苷的苷元,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病、保护肝功能等多种药理活性[3]。已有研究发现,柚皮素对糖尿病肝损伤有预防作用[4],但对已经形成的糖尿病肝损伤改善作用的研究较少,其相关机制尚未阐明。过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)属于核激素受体超家族,其3种不同亚型,即PPARα、PPARβ和PPARγ均参与了细胞增殖与分化、机体炎症反应、糖脂物质代谢等重要的生物调节过程。现已公认,PPARs调控异常与糖尿病、高血压、高血脂等代谢紊乱性疾病的发生密切相关[5]。任凯强等[6]的研究发现,PPARs信号通路下调在糖尿病肝损伤的发生发展中具有重要作用。已有实验提示,柚皮素可激活PPARα和PPARγ,在基因水平调节肝细胞的脂质代谢[7];柚皮素激活PPARβ,可使高脂模型大鼠血脂水平降低[8];通过激动PPARγ相关信号途径,柚皮素也可改善大鼠认知缺陷[9],减轻脓毒症小鼠的肠损伤[10]。那么,在糖尿病肝损伤中,柚皮素的作用是否也与其对PPARs信号通路的激活有关,目前未见研究报道。因此,本研究通过在糖尿病小鼠肝损伤模型中予以不同剂量的柚皮素,初步观察柚皮素的改善作用,以及该作用与PPARs的关系。

1 材料与方法

1.1 试验药物 柚皮素(HPLC,95%)为Sigma公司产品,混悬于羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na),配制成所需浓度。

1.2 实验动物 实验用清洁级6～8周龄的雄性昆明小鼠40只,体重约(18±2)g;由重庆医科大学实验动物中心提供【许可证号:SYXK(渝)2012-0001】。建模前,所有小鼠适应性喂养1周。

1.3 试剂 链脲菌素(streptozotocin,STZ)购自Sigma公司,用枸橼酸缓冲液溶解后,调节pH值4.1 ～ 4.4,临用前配制;Trizol、SYBR Green Supermix和逆转录试剂盒购自Takara生物制剂公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂(PMSF)和RIPA裂解液购自江苏碧云天生物技术公司;PPARα、PPARβ和PPARγ鼠多抗购自北京博奥森生物科技公司;天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷氨酸-丙酮酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆固醇(total cholesterol,TCH)、甘油三酯(triglyceride,TG)检测试剂盒均为南京建成生物技术公司产品。

1.4 仪器 垂直电泳仪(北京六一);CFX Connect TN定量PCR仪、凝胶成像图像分析系统和ELX-800酶标仪(Bio-Rad公司);光学显微镜(日本 NIKON);血糖仪(强生医疗器材有限公司)。

1.5 动物模型的建立 将小鼠随机分为正常对照组(normal control,NC,n=10)和模型组(model,n=30)。模型组小鼠予高糖高脂饲料喂养4周后,连续5 d腹腔注射予STZ[40 mg/(kg·d)]。7 d后(即STZ 7 d),检测小鼠的空腹血糖水平(FBG),FBG ≥11.1 mmol/L视为糖尿病小鼠(diabetic model,DM)。继续喂养4周后,糖尿病肝损伤形成[9-11]。将糖尿病肝损伤小鼠随机分为3组(n=10),分别为:①糖尿病肝损伤模型组:等剂量CMC-Na;②柚皮素低剂量组:NAR 25 mg/(kg·d);③柚皮素高剂量组:NAR 75 mg/(kg·d)。灌胃持续4周[11-13]。此外,正常对照组小鼠常规饲料喂养4周后,予等量的枸橼酸缓冲液腹腔注射,连续5 d;7 d后检测其FBG水平,4周后给予等剂量CMC-Na灌胃。观察小鼠状态,每周检测小鼠的FBG水平。

1.6 生化指标检测 小鼠眼眶取血、离心、取上清液。严格按照试剂盒说明书操作,检测不同波长光密度值(AST和ALT:510 nm;TCH和TG:490 nm),根据标准曲线计算各相应指标的浓度。

1.7 组织病理学检测 脱颈椎处死小鼠,取出肝脏,用4%多聚甲醛浸泡固定24 h,石蜡包埋,将石蜡块作5 μm冠状切片,行HE染色,于200×视野下观察小鼠肝脏形态学改变。

1.8 qRT-PCR检测PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA表达 引物设计参照GenBank中小鼠的基因序列(表1),合成验证单位为上海英潍捷基生物技术有限公司。提取肝脏组织总RNA,并测定其浓度。而后利用逆转录酶合成cDNA,采用SYBR Green荧光技术,进行PCR扩增。扩增条件如下:95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s,循环39次。以β-actin作为参考基因,统计Ct值,根据相对定量公式对结果进行分析。

表1 引物序列

1.9 Western Blot法检测PPARα、PPARβ、PPARγ蛋白表达 按照蛋白提取说明书步骤,对肝脏组织的总蛋白进行提取,使用BCA法测定蛋白含量,并进行定量。取30 μg蛋白置于垂直电泳中进行分离,转移40 min至PVDF膜上,5 % BSA封闭2 h,加入一抗(β-actin按1∶2 000稀释,其余均按1∶1 000稀释),4 ℃摇床孵育过夜,TBST漂洗3次后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗 (1∶2 000稀释),室温摇床孵育1 h,漂洗3次。用ECL发光试剂显色,Bio-Rad成像系统成像,用Image Lab软件分析结果。

2 结果

2.1 柚皮素对小鼠一般情况及血糖的影响 正常小鼠在实验期间无死亡,一般情况良好;模型组小鼠在建模期间进水量和尿量均明显增加、伴随精神萎靡,毛色晦暗无光泽;给予STZ后至实验结束,模型组小鼠共死亡2只,柚皮素给药治疗组无小鼠死亡。给予STZ 7 d后,小鼠的FBG水平明显升高(P<0.01),且模型组小鼠FBG一直维持在20 mmol/L以上直至实验结束。4周后给予柚皮素,可剂量依赖性地降低糖尿病肝损伤小鼠的FBG(P<0.05),但仍然远高于11.1 mmol/L的糖尿病诊断标准。结果见图1。

FBG:空腹血糖;STZ:链脲菌素; DH:糖尿病肝病;##:与正常对照组比,P<0.01;*、**:与模型组比较,P<0.05、P<0.01;n=8～10。图1 各实验组小鼠空腹血糖值变化情况

2.2 柚皮素对糖尿病小鼠肝脏结构、功能及血脂的影响 小鼠肝脏HE染色提示,正常组小鼠肝小叶结构清晰完整,肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞形态结构正常(图2 A);模型组小鼠肝细胞排列紊乱,细胞肿胀明显,其标志性结构肝小叶消失,肝细胞胞质内出现大小不等、有张力的空泡,胞浆内可见许多脂滴,局部炎细胞呈灶性浸润,表示模型组小鼠出现了明显的肝损伤(图2 B);同时,模型组小鼠肝功能指标AST、ALT水平较正常组显著升高,血脂(TCH和TG)也明显升高(P<0.01)。

A:正常对照组;B:模型组;C:柚皮素组:25 mg/(kg·d);D:柚皮素组:75 mg/(kg·d);HE染色,×200。图2 各实验组小鼠肝组织病理变化情况

不同剂量柚皮素[25 mg/(kg·d)、75 mg/(kg·d)]干预后,AST和ALT水平均呈剂量依赖性地降低(P<0.05)。HE染色显示肝细胞损伤明显改善,肝小叶的紊乱程度缓解,脂肪空泡数量减少,肝细胞肿胀减轻,柚皮素高剂量组作用更为明显(图2 C、D)。同时,TCH和TG水平也呈剂量依赖性下降(P<0.05)。结果见图2和表2。

表2 柚皮素对糖尿病小鼠肝功能和血脂水平的影响

2.3 柚皮素对肝脏PPARα、PPARβ、PPARγ mRNA和蛋白表达的影响 与正常对照组比较,模型组小鼠肝脏PPARα、PPARβ和PPARγ的m RNA均明显下降(P<0.01),mRNA表达分别减少了62.1%、49.3%、78.8%;蛋白表达也明显下调(P<0.01),分别减少了68.7%、63.8%、48.4%。柚皮素能浓度依赖性的上调PPARs mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结果见图3和图4。

##:与正常对照组比,P<0.01;*、**:与模型组比较,P<0.05、P<0.01;n=3。图3 各实验组小鼠肝脏组织PPARs mRNA表达情况

##:与正常对照组比,P<0.01;*、**:与模型组比较,P<0.05、P<0.01;n=3。图4 各实验组小鼠肝脏组织PPARs蛋白表达情况

3 讨论

糖尿病及其并发症发病率和死亡率均较高,对人们的身体健康和生活质量产生了广泛而严重的影响。除常见的糖尿病肾病、糖尿病神经病变和视网膜病变等并发症外,糖尿病肝病在糖尿病患者中的发生率也越来越高,但因其临床表现少,症状不典型,经常被忽视。随着其导致的终末期肝病死亡率的增加,糖尿病患者并发NAFLD、NASH等肝脏疾病也引起了广泛的关注和重视[14]。本课题组前期动物实验证实,长期高能量饲料喂养结合多次小剂量链脲菌素的给予可导致糖尿病肝损伤发生[11-13]。此次实验期间,模型小鼠FBG值持续高于11.1 mmol/L,提示小鼠出现糖尿病且保持稳定;模型组小鼠TCH和TG水平明显升高,提示糖尿病小鼠伴发血脂紊乱;肝脏组织形态学检查显示,模型组小鼠肝细胞内脂肪变性并伴有炎性细胞浸润,小鼠血清AST、ALT水平显著升高,提示糖尿病小鼠的肝损伤已从NAFLD进展到NASH阶段。

柚皮素是一种天然的二氢黄酮类化合物,具有广泛的药理学活性。研究发现,柚皮素对糖尿病引起的心肌损伤、视网膜损伤以及神经病变均有改善作用[3,15],但关于柚皮素对糖尿病引起的肝损伤的研究报道较少。本实验中,给予柚皮素低及高剂量治疗均能显著降低AST和ALT水平,改善肝损伤病理状态,减少脂肪空泡数量及炎症细胞浸润,提示柚皮素对糖尿病小鼠肝损伤有改善作用。尽管柚皮素也能降低糖尿病小鼠FBG水平和TCH及TG水平,但仍远高于正常对照组,提示柚皮素对糖尿病肝损伤的保护作用并不完全是通过调控血糖和血脂水平产生的。

我们前期研究已经证实,糖尿病肝损伤小鼠肝脏的PPARα、PPARβ和PPARγ表达显著降低,提示PPARs信号通路可能参与了糖尿病肝损伤的病理生理过程[6,13],PPAR受体的3种亚型可能都是糖尿病肝损伤防治的重要作用靶点。罗映等[16]利用放射性配基结合实验和反式激活报道基因法发现柚皮素可同时激活hPPARα、hPPARβ和hPPARγ受体,可能是一个PPAR泛激动剂。本课题组最近研究也发现[17],在糖尿病小鼠心肌肥厚模型,柚皮素的保护作用与其对PPARα、PPARβ和PPARγ的激活有关。与之相似,本研究结果也显示,柚皮素在改善糖尿病肝损伤病理变化和肝功能下降的同时,能够显著上调PPARα、PPARβ和PPARγ蛋白和mRNA表达。这些结果提示,柚皮素对糖尿病肝损伤的改善作用可能与其激活PPARs受体有关。

综上所述,柚皮素对于糖尿病肝损伤具有改善作用,该作用可能与柚皮素激活PPARα、PPARβ和PPARγ的表达有关。本研究初步观察的结果提示,柚皮素有可能成为治疗糖尿病肝损伤并发症的有效药物。但由于糖尿病肝损伤病理生理机制的复杂性及柚皮素作用的广泛性,柚皮素在糖尿病肝损伤中的作用还需进行更多临床前及临床的深入研究。