曹巍巍 刘晨萍 袁晨越 薛永鹏

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是各类心血管疾病迁延不愈发展到后期的转归。数据统计显示,中国心血管疾病患病率处于持续上升状态,心血管病病死率仍居首位,目前患病人数为3.30亿,其中心力衰竭890万,2012～2015年≥35周岁的成年人中,心力衰竭的患病率为1.3%,较2000年增加了44.0%[1,2]。具有温阳利水功效的强心方是经临床验证治疗CHF的有效方剂,但其改善CHF症状的具体机制尚未明确[3]。本研究拟通过腹腔注射阿霉素(doxorubicin,Dox)建立CHF模型,以正常及高剂量的强心方进行干预,观察强心方对小鼠心功能的影响,为阐明强心方对CHF的保护及治疗机制提供实验基础[4～6]。

材料与方法

1.实验动物：SPF级5～6周龄C57小鼠,雄性,42只,体质量为20±2g,上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物许可证号为SYXK(沪)2014-0008。饲养于上海市中医医院SPF级动物实验室,自由摄食饮水。所有实验均按照上海中医药大学附属市中医医院医学伦理学委员会和国际动物福利标准的指导方针进行。

2.主要试剂与仪器：ELISA试剂盒(货号ml102853)购自上海酶联生物科技有限公司;OCT包埋剂(货号4583)购自美国SAKURA公司;Masson 三色染色液(货号BP-DL022)购自森贝伽生物技术有限公司;RNA提取液(货号G3013)购自武汉赛维尔生物科技有限公司;三氯甲烷(货号10006818)、异丙醇(货号80109218)、无水乙醇(货号10009218)均购自国药集团化学试剂有限公司;HyPure TMMolecular Biology Grade Water(货号SH30538.02)购自美国HyClone公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(货号#K1622)购自美国Thermo公司;FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(货号04 913 914 001)购自瑞士Roche公司;引物(NM_008084.2;NM_008725.3;NM_001361607.1)购自武汉擎科创新生物科技有限公司;酶标仪(352)购自芬兰Labsystems Multiskan MS公司;洗板机(AC8)购自芬兰Thermo Labsystems公司;台式高速冷冻型微量离心机(D3024R)购自美国DragonLab公司;荧光定量PCR仪(7300)购自美国ABI公司;超微量分光光度计(NanoDrop2000)购自美国Thermo公司;冷冻切片机(HM525)购自美国Thermo Fisher Scientific公司;倒置荧光显微镜(IX51)购自日本Olympus公司。

3.模型建立及实验分组：正常组(n=6)、模型组(n=8)、强心方低剂量组(n=12)、强心方高剂量组(n=11)。参考文献[7,8]及前期预实验,将48只SPF级5～6周龄,体质量为20～25g,雄性C57小鼠适应性喂养1周后,随机选取6只小鼠为正常组,将余下42只小鼠采用腹腔注射阿霉素0.005mg/g,每隔3天间隔注射,共计30天。总计腹腔注射阿霉素0.05mg/g,制作小鼠CHF模型(造模过程中死亡11只,造模成功31只),正常组小鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。将造模成功的31只小鼠随机分为模型组(n=8),强心方低剂量组(n=12),强心方高剂量组(n=11)。强心方低剂量组给于中药强心方低剂量(正常剂量)每日灌胃,强心方高剂量组给于中药强心方高剂量(2倍正常剂量)每日灌胃,模型组及正常组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃,每天灌胃1次,共计30天后取材。

4.中药强心方药物组：附子15g、茯苓15g、补骨脂15g、车前子15g、川芎15g、黄芪30g、党参15g、桂枝9g、鹿角片15g、女贞子15g、肉桂6g、葶苈子30g、桃仁15g、太子参15g、猪苓15g(饮片购自江阴天江药业有限公司),普通水煎1小时,桃仁、肉桂后下,得到浓度为含生药量2.7g/ml的水煎液。实验时加蒸馏水分别配置成含生药量1.25g/ml和2.5g/ml的药液。

5.参考《药理实验方法学》[9]计算小鼠给药剂量：按给药30天,共31只小鼠,每只给药0.2ml,计算所需药量：0.2ml×31只×30天=186ml。强心方低剂量、高剂量组分别按照正常浓度1.25g/ml,2倍浓煎2.5g/ml的梯度设置,正常组、模型组同等体积0.9%氯化钠注射液,每天灌胃1次,共30天。

6.超声心动图检测及取材：使用设备品牌型号为百胜MyLab 8 eXP。灌胃30天结束后,采用异氟烷麻醉小鼠,通过高分辨率小动物超声系统M模式测定5个心动周期左心室舒张期内径(left ventricular internal diastolic diameter,LVIDd)、左心室收缩期内径(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV),计算短轴缩短率(FS%)及射血分数(EF%)。FS%=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd;EF%=(LVEDV-LVESV)/LVEDV。检测完成后于麻醉下眼眶取血并处死小鼠,取心脏称重,并使用胫骨长度矫正相对值。沿心脏横轴切取一半心脏-80℃冷冻用于RNA检测,另一半用于Masson检测。

7.ELISA：检测仪器为酶标分析仪Rayto RT-6100。将各组小鼠眼眶取血,并于4℃、5000×g离心5～10min,取上清。根据ELISA试剂盒说明书进行ELISA检测,在450nm的波长下测定A值。根据标准曲线计算各样本中BNP含量。

8.Masson三色染色：取各组冰冻切片,用PBS稍洗。将Bouin液滴加在组织上,放于37℃烘箱2h,进行媒染,然后流水冲洗切片至黄色消失。滴加100μl天青石蓝染色液,染色2～3min。稍水洗,滴加Mayer苏木精染色液,染色2～3min。稍水洗,酸性乙醇分化液处理1～2min。流水冲洗10min,滴加丽春红品红染色液,染色10min。蒸馏水稍冲洗,磷钼酸溶液处理约10min。倾去上液,直接滴加苯胺蓝染色剂衬染5min。蒸馏水稍冲洗,脱水和透明后中性树脂封片。

9.RT-qPCR：采用Trizol法提取小鼠心肌组织总RNA,进行反转录,配置如下反应体系：2×qPCR Mix 12.5μl,7.5μm基因引物 2.0μl,反转录产物 2.5μl,ddH2O 8.0μl,PCR反应条件：95℃预变性10min,95℃变性15s、60℃退火20s、75℃延伸20s共40个循环,75℃延伸5min,反应结束后对Ct值采用2-ΔΔCt法进行定量分析。引物序列：Anp上游引物：5′-TGCCCTCTTGAAAAGCAAACTG- 3′,下游引物5′-CTGGGCTCCAATCCTGTCAAT- 3′。β-MHC上游引物：5′-ATCAAATCATCCAAGCCAACCC- 3′,下游引物5′-GCATAATCGTAGGGGTTGTTGGT- 3′。Gapdh上游引物5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG- 3′,下游引物5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT- 3′。以Gapdh为内参,计算Anp,β-MHC mRNA表达量。

结 果

1.小鼠生存情况：CHF发生后,正常组小鼠行动敏捷、反应迅速、毛发有光泽、体质量持续稳定上升,30天灌胃过程中未出现死亡;模型组小鼠反应迟缓、毛发稀疏无光泽、饮食饮水量减少、体质量消瘦,30天灌胃过程中出现较多死亡;经强心方干预治疗后,相较于模型组,强心方低剂量及高剂量组小鼠行动相对自如、毛发恢复部分光泽,30天灌胃过程中仅出现较少死亡,详见表1。

表1 各组小鼠治疗期间死亡情况

2.超声心动图心功能水平：CHF发生后,相较于正常组,模型组小鼠心功能水平明显下降,超声心图提示模型组小鼠左心室舒张期、收缩期内径均显著上升,短轴缩短率及射血分数显著下降。强心方干预治疗后,相较于模型组,强心方低剂量及高剂量组小鼠心功能明显改善,左心室舒张期、收缩期内径明显下降,短轴缩短率及射血分数明显上升,详见图1、表2。

图1 超声心动图A.正常组;B.模型组;C.强心方低剂量组;D.强心方高剂量组

表2 超声心动图M模式评价各组小鼠心脏结构及功能

3.心力衰竭指标BNP水平：ELISA检测小鼠血清发现,相较于正常组,模型组小鼠血清BNP指标显著升高。经强心方干预治疗后,强心方低剂量及高剂量组小鼠血清BNP指标明显下降,详见表3。

表3 各组小鼠血清BNP指标比较

4.Masson三色染色心肌纤维化程度：心肌组织切片按Masson三色染色试剂盒步骤操作,使用Imagine-ProPlus软件镜下观察拍照,并计算胶原容积分数(CVF)。显微镜下,心肌组织为红色,胶原纤维为蓝色。CVF(%)=胶原纤维染色面积/切片总面积×100%。Masson三色染色显示,模型组小鼠心肌细胞出现明显纤维化,与正常组比较,模型组可见蓝色染色的胶原纤维增多。与模型组比较,强心方低剂量及高剂量组胶原纤维面积明显减少,心肌细胞纤维化程度减轻,详见图2、表4。

图2 各组小鼠心肌组织病理图(Masson三色染色,×40)A.正常组;B.模型组;C.强心方低剂量组;D.强心方高剂量组

表4 各组小鼠心肌纤维化率

5.心肌组织Anp、β-MHC表达：RT-qPCR检测心肌组织Anp、β-MHC mRNA表达情况显示,相较于正常组,模型组Anp、β-MHC mRNA相对表达量显著上升。相较于模型组强心方低剂量及高剂量组Anp、β-MHC mRNA相对表达量显著下降,详见表5。

表5 RT-qPCR检测各组小鼠心肌组织Anp和β-MHC mRNA表达情况

讨 论

CHF可归属于中医“心悸”、“胸痹”、“心水”、“水肿”等病证的范畴,作为多种慢性心系疾病反复发展、迁延不愈的最终归属,临床CHF患者多已气虚及阳。心阳虚衰,心失所养,故心血不运,血脉瘀阻,随着病情的不断发展逐渐出现瘀久成积、瘀血化水,其病机可概括为虚、瘀、水,病理基础为心阳亏虚,血瘀为中心病理环节,痰浊、水饮主要病理产物[10]。本研究采用的强心方由真武汤及五苓散化裁而来,方中使用大剂量附子为君药,配合肉桂、补骨脂、鹿角片等温阳药物,附子辛热燥烈,走而不守,为通行十二经的纯阳之品,峻补元阳[11～15]。肉桂能走能守,偏温下焦而温肾阳,使相火归原以摄无根之火;补骨脂补肾助阳、温补脾肾;鹿角片血肉有情之品大补肾阳、益精血、强筋骨。此外,方中兼顾黄芪、党参、太子参补益脾肺之气;女贞子滋补肝肾之阴;茯苓、猪苓、车前子利水;桃仁、川芎活血化瘀。全方重在温补心肾之阳,肾阳充盛则可上济于心,心阳充足也可下归于肾,温煦全身阳气,气血得以鼓舞,气行则血行,血脉得以温通,血脉通则瘀血乃化,起到温阳益气、活血利水之功效。

阿霉素的心脏毒性源于其诱导氧化应激并促进自由基的产生,当活性氧簇的产生速度大于抗氧化防御系统的清除速度时,会促进心肌细胞凋亡、坏死和自噬,被广泛应用于HF动物模型的建立。经过多次预实验研究,最后选择了死亡率较低的小剂量、低浓度、多次给药的方法。采用腹腔注射阿霉素0.005mg/g,每隔3天间隔注射,共计30天,该建模方法模拟了小鼠的慢性心力衰竭。

目前已基本明确心室重构(ventricular remodeling,VR)是CHF发生、发展的重要机制,初期CHF心肌损伤后,代偿机制被激活,心脏通过心室结构及大小的变化适应损伤,然而心功能持续恶化,心室形态不断增大,逐步导致二尖瓣关闭不全,引发血液部分回流,无法满足机体所需的供应,导致CHF一系列症状[16]。现阶段VR治疗效果并不理想,多数治疗仅能延缓VR的进展[17]。随着中医药治疗CHF研究的深入,逐步发现中药治疗VR具有多靶点、多途径的综合干预的优势[18]。本实验表明强心方能够明显降低CHF小鼠LVIDd、LVIDs,提高FS%和EF%水平,表明强心方对CHF小鼠心脏结构与功能具有一定改善作用。

心肌细胞作为终末分化的成熟细胞,目前认为已不具有增殖功能。当心脏损伤出现时,其多通过引起心肌细胞肥大进行代偿应对损伤压力,然而随着损伤的不断加重,心肌细胞肥大终将走向失代偿加重CHF的发生、发展[19]。Anp和β-MHC作为心肌肥厚标志物,本实验表明,相较于CHF模型组,强心方低剂量及高剂量组Anp、β-MHC mRNA相对表达量显著下降,提示强心方能够在一定程度上抑制心肌肥大。

心肌纤维化作为一种瘢痕形成过程是心肌重要的病理特征之一,当损伤发生时,心脏成纤维细胞大量积累并伴随着细胞外基质蛋白过量沉积,引起心肌硬化、心脏收缩舒张功能障碍,引起CHF不断恶化,同时过量的细胞外基质还将增加心律不齐的风险[20]。Masson三色染色显示,与CHF模型组比较,强心方治疗后心肌组织胶原纤维面积明显减少,表明强心方能够有效改善心肌细胞纤维化程度。

综上所述,中药强心方可以一定程度上改善小鼠心功能水平,增加射血分数,降低血清BNP水平,调控Anp、β-MHC等心肌肥厚相关基因、减轻心肌纤维化等多途径延缓VR进程,对治疗CHF具有一定的疗效。