李文倩 郑仕杰 万少枝 李册兴 孙培媛 吕建峰

长期的焦虑是动脉粥样硬化的一个独立风险因素,肥胖对动脉粥样硬化的发展和随之而来的心血管疾病有重大影响[1,2]。流行病学还指出,焦虑与一系列心血管事件的发生呈正相关[3]。研究表明,过度肥胖的人群与冠心病等心血管疾病的患病率会更高[4]。通常情况下认为,一个人可同时发生焦虑和肥胖,更重要的是,影响一个因素可能会对另一个因素产生协同作用。既往的研究大都是基于慢性压力对情绪反应、心肌细胞功能、心脏代谢标志物及其他系统如肝脏和肠道的影响的分析[5～8]。之前没有关于焦虑和肥胖这两个风险因素引发的共同作用对动脉粥样硬化的研究。

研究发现,慢性压力可引起炎性细胞因子升高使机体产生应激反应,脂肪组织的慢性低度炎症介导肥胖等代谢性疾病的发展机制[9,10]。Toll样受体(toll-like receptor,TLR)是介导天然免疫反应的模式识别受体,在炎症和免疫应答过程中具有重要作用,其广泛分布于免疫器官和心脏、脑、肾脏等器官组织内[11]。TLR4可以识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式来激活下游相关信号通路,导致炎症过程的级联反应。鉴于这些事实,笔者假设TLR4介导的炎症作用可作为焦虑和肥胖导致动脉粥样硬化不利影响的潜在指标。

材料与方法

1.实验动物：SPF级雄性C57BL/6J小鼠由三峡大学实验动物中心提供,体质量为18～19g。本实验经三峡大学实验动物中心伦理学委员会批准(伦理学审批号：2020010A)。将小鼠置于昼夜节律光照条件下,自由进食水,饲养1周适应环境。随机将32只小鼠分为对照组(普通饮食)、焦虑组[慢性不可预测轻度应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)]、肥胖组(高脂饮食)和焦虑+肥胖组(CUMS+高脂饮食),每组各8只,干预16周。

2.试剂与仪器：高脂饲料(TP23300)购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司、酶标仪(ELx808 Biotek)、移液器(EPPendorf)、化学发光仪(CLINX6300)、灰度分析软件(美国AlPha Innotech公司)、图像分析软件(Adobe)、ELISA试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)、兔多抗tlr4 95kDa(武汉三鹰生物技术有限公司)、β-actin 42kDa(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

3.焦虑模型的建立：以慢性轻度不可预见刺激,配合孤养建立焦虑模型[12]。造模方法：冰水游泳(4℃,5min),热水游泳(45℃,5min),禁食、禁水24h,夹尾1min,昼夜颠倒24h,居住环境改变(空垫料或潮湿垫料),倾斜鼠笼24h等。

4.肥胖模型的建立：普通饮食含有20%蛋白质,70%碳水化合物,10%脂肪,高脂饮食含有20%蛋白质,20%碳水化合物,60%脂肪。肥胖组小鼠的平均体质量高出对照组小鼠的20%,表示肥胖模型的成功建立[13]。

5.行为学评估：(1)旷场实验：旷场装置为长宽各50cm、高30cm的木箱。将小鼠放入中心方格内,观察小鼠在5min内总运动距离、中央活动距离、中央区活动时间百分比。(2)高架十字迷宫实验：高架十字迷宫为两条开臂(50cm长×10cm宽×40cm高)和两条闭臂(50cm长×10cm宽×40cm高)及中心区(10cm×10cm)连接而成。观察小鼠在5min内进入开臂的次数及时间百分比。以上实验中每只小鼠观察结束后,喷洒75%的乙醇并清洗装置。

6.ELISA检测：行为学检测后当天将小鼠摘眼球取血,提取血清,参照武汉云克隆科技股份有限公司小鼠白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA分析试剂盒使用说明书步骤进行实验操作,每孔均做3个复孔以减少误差。

7.全自动生化分析仪器检测血脂变化：利用全自动生化分析仪器检测血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholestrol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholestrol,HDL-C)的水平。

8.HE染色检测主动脉斑块情况：行为学检测后当天将小鼠断头取脑,固定脑组织,经脱水、包埋、切片、染色,观察结果并拍照存档。

9.IHC检测主动脉斑块中TLR4的表达：行为学检测后当天将取出小鼠主动脉,固定主动脉,经脱水、包埋,加入固定抗体,显色、复染、脱水,封片后将其放在光镜下观察并拍照存档,用Image Pro Plus 7.0图像分析系统做图像数字采集及半定量分析。

结 果

1.旷场实验结果：4组小鼠在旷场实验中总运动距离比较,差异无统计学意义。与对照组比较,焦虑组、肥胖组中央运动距离下降(P<0.05),中央活动时间百分比明显下降(P<0.001)。与焦虑组、肥胖组比较,焦虑+肥胖组小鼠中央运动距离下降(P<0.01),中央活动时间百分比明显下降(P<0.001 vs 肥胖组,P<0.01 vs 焦虑组);其中焦虑和肥胖对中央运动距离的主效应显著(F=36.012,P<0.001;F=34.813,P<0.001),对中央活动时间百分比的主效应显著(F=324.802,P<0.001;F=204.074,P<0.001),焦虑联合肥胖对中央运动距离没有交互作用(F=1.918,P=0.203),对中央活动时间百分比的交互作用显著(F=57.614,P<0.001,图1)。

图1 各组小鼠旷场实验结果与对照组比较,*P<0.05,**P<0.001;与肥胖组比较,#P<0.01,##P<0.001;与焦虑组比较,△P<0.05,△△P<0.01

2.高架十字迷宫结果：与对照组比较,焦虑组、肥胖组小鼠进入开臂的时间和次数百分比明显下降(P<0.001);与焦虑组、肥胖组比较,焦虑+肥胖组小鼠进入开臂的次数百分比明显下降(P<0.01 vs 肥胖组,P<0.05 vs 焦虑组)、进入开臂的时间百分比明显下降(P<0.001);其中焦虑和肥胖对小鼠进入开臂次数百分比的主效应显著(F=89.561,P<0.001;F=57.711,P<0.001),对小鼠进入开臂时间百分比的主效应显著(F=257.134,P<0.001;F=110.201,P<0.001),焦虑联合肥胖对小鼠进入开臂的次数百分比交互作用显著(F=8.167,P<0.05),对进入开臂的时间百分比没有交互作用(F=4.907,P=0.058,图2)。

图2 各组小鼠高架十字迷宫实验结果与对照组比较,*P<0.001;与肥胖组比较,#P<0.01,##P<0.001;与焦虑组比较,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001

3.体质量变化结果：与对照组(28.81±1.23g)和焦虑组(27.05±0.53g)比较,肥胖组(34.84±1.24g)和焦虑+肥胖组(32.53±0.80g)在第16周的体质量增加(P<0.001),表示肥胖模型建立成功(肥胖组体质量大于对照组的20%);与对照组比较,焦虑组在第4周、第8周、第12周、16周的体质量下降(P分别为<0.001、<0.001、<0.05、<0.01)。然而,与焦虑+肥胖组比较,肥胖组在第8周、第12周、16周表现出更高的体质量(P<0.001)。与第0周比较,对照组在第16周也显示出体质量增加(P<0.001)。其中时间、焦虑、肥胖对体质量没有交互作用(F=1.715,P=0.178);焦虑与时间的交互作用(F=11.981,P<0.001)、肥胖与时间的交互作用(F=40.356,P<0.001)、焦虑的主效应(F=75.417,P<0.001)、肥胖的主效应(F=325.615,P<0.001)显著;焦虑联合肥胖对体质量没有交互作用(F=0.917,P=0.347,图3)。

图3 各组小鼠0、4、8、12、16周体质量变化与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与焦虑+肥胖组比较,#P<0.01,##P<0.001

4.血脂水平：与对照组比较,肥胖组中TC、TG和LDL-C升高(P<0.05),HDL-C水平显著降低(P<0.001),而焦虑组中血脂改变差异无统计学意义;与肥胖组比较,焦虑+肥胖组中TC、TG和LDL-C更高(P<0.05),HDL-C无明显改变;与焦虑组比较,焦虑+肥胖组中TC和LDL-C显著升高(P<0.01),TG明显升高(P<0.001),HDL-C显著降低(P<0.001);其中焦虑对TC、TG的主效应显著(P<0.05);焦虑对LDL-C、HDL-C的主效应不显著;肥胖对TC的主效应显著(P<0.01),对TG、LDL-C、HDL-C的主效应更加显著(P<0.001);焦虑联合肥胖干预对血脂变化没有交互作用(表1和表2)。

表1 各组小鼠血脂变化情况

表2 各组小鼠血脂变化情况的双因素方差分析表

5.HE染色检测小鼠主动脉粥样硬化结果：对照组中主动脉血管壁内膜光滑完整,血管平滑肌细胞排列整齐,未见脂质沉积及管腔狭窄;焦虑组中主动脉血管平滑肌细胞排列紊乱及部分血管内皮细胞损伤,可见少量泡沫细胞;肥胖组中主动脉血管内皮细胞损伤,可见大量泡沫细胞、少量脂质沉积及粥样硬化;焦虑+肥胖组中主动脉血管腔严重狭窄,可见斑块面积较大,且斑块表面由薄且不稳定的纤维帽覆盖,其斑块下可见坏死崩解物质及泡沫细胞等(图4)。

图4 各组小鼠中主动脉组织形态学变化

6.免疫组化检测小鼠主动脉斑块中TLR4的表达结果：与对照组比较,肥胖组TLR4在主动脉斑块的表达明显增多(P<0.05),焦虑组TLR4在主动脉斑块的表达差异无统计学意义;与焦虑组、肥胖组比较,焦虑+肥胖组TLR4在主动脉斑块的表达更多(P<0.01);其中焦虑和肥胖对主动脉斑块TLR4的主效应显著(F=14.055,P<0.01;F=24.183,P<0.001),但焦虑联合肥胖没有交互作用(F=0.857,P=0.366,图5)。

图5 各组小鼠中主动脉中TLR4的表达情况与对照组比较,*P<0.05,**P<0.001;与肥胖组比较,#P<0.01;与焦虑组比较,△P<0.01

7.ELISA检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量表达结果：与对照组比较,焦虑组、肥胖组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显增多(P<0.001);与焦虑组、肥胖组比较,焦虑+肥胖组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达增加更多(P<0.001);其中焦虑和肥胖对血清中IL-1β的主效应显著(F=3029.620,P<0.001;F=3102.544,P<0.001),对血清中IL-6的主效应显著(F=1203.733,P<0.001;F=1221.181,P<0.001),对血清中TNF-α的主效应显著(F=877.930,P<0.001;F=872.725,P<0.001),且焦虑联合肥胖对血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的交互作用显著(F=171.555,P<0.001;F=458.255,P<0.001;F=23.877,P<0.001,图6)。

图6 各组小鼠血清炎性细胞因子表达水平与对照组比较,*P<0.001;与肥胖组比较,#P<0.001;与焦虑组比较,△P<0.001

讨 论

本研究观察了焦虑和肥胖导致小鼠动脉粥样硬化的形成,并探讨血清炎性细胞因子及TLR4在其中的作用。本研究发现单独焦虑仅引起血管内皮相对紊乱,单独肥胖可以导致动脉粥样硬化,当合并时会明显加剧动脉粥样硬化程度并导致斑块不稳定,其中TLR4表达无交互作用,血清炎性细胞因子水平上调有显著交互作用;焦虑或肥胖时都可以引起明显的焦虑行为,两者合并时会大大增加焦虑行为表现;焦虑可明显减少高脂饮食和普通饮食喂养的小鼠的体质量增加,但增加了高脂饮食组中血脂的变化。

截至目前,研究主要集中在对慢性压力的自主神经反应和心肌功能上,而没有研究动脉粥样硬化程度和性质[5]。本研究表明,肥胖叠加焦虑时才会诱发明显动脉粥样硬化程度,同时导致不稳定斑块的形成。焦虑组中血管变化不明显,只有高脂饮食后才会形成斑块,且在焦虑作用下肥胖小鼠的动脉粥样硬化程度最重,并形成不稳定性斑块。因此,笔者猜想焦虑是肥胖小鼠致不稳定性斑块形成的关键决定因素。

本研究结果还表明,定期摄入高脂饮食会增加体质量和血脂的变化,然而焦虑会减少体质量增加,反而增加了高脂饮食组中血脂的水平。压力似乎以两种方式影响体质量的变化,导致暴饮暴食或饮食减少,这可能是受到压力源严重程度的影响,从本实验可以看出在第4、8周时焦虑组较对照组中体质量的增加减少是最明显,可能由于才开始接受CUMS时小鼠对食物偏好明显受到影响,在第8、16周时体质量似乎比之前减少更为缓慢,长期慢性压力会导致小鼠产生适应性最终导致体质量减少不明显[14]。与对照组比较,焦虑组中血脂水平并没有明显改变,合并症组中血脂水平较肥胖组中增加,这与既往研究结果一致[8]。可以解释为高脂饮食对血脂和海马胆固醇之间的关联产生了积极的影响[15]。然而后来却有相反的结果,甘油三酯在压力合并高脂饮食中没有明显改变,甚至出现少许下降[6]。鉴于以上发现,进一步研究压力与高脂饮食之间对胆固醇代谢的相互作用,可为心血管疾病提供一个新的见解。

焦虑、肥胖和焦虑合并肥胖时都可以引起明显的焦虑行为,这与既往研究结果一致[7]。从机制上分析,全身炎性细胞因子水平的升高是动脉粥样硬化发展中的关键因素,在这项研究中,无论是单独焦虑或肥胖或合并组都能够导致炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的升高[16]。因此,炎症是焦虑和肥胖导致动脉粥样硬化的桥梁。众所周知,TLR4是天然免疫反应模式识别受体家族中的一员,在炎症和免疫应答过程中具有重要作用,其与动脉粥样硬化关系最为密切[11]。有研究发现,CUMS诱导的抑郁症小鼠海马TLR4水平明显升高[17]。本实验检测了主动脉斑块中TLR4的表达情况,结果显示,肥胖显著增加了TLR4的表达,其焦虑+肥胖组中TLR4的表达更高但无交互作用,与血清炎性细胞因子的升高呈平行关系。

综上所述,焦虑合并肥胖时会导致最为严重的动脉粥样硬化并导致斑块的不稳定,以及最高的TLR4和炎性细胞因子水平。肥胖但无焦虑的小鼠在各组中血脂水平最高,单独焦虑、单独肥胖和焦虑+肥胖组都增加了焦虑行为。因此,本研究表明,焦虑联合肥胖加剧动脉粥样硬化程度,导致血清脂质水平异常和血清中炎性细胞因子增加,这些影响可能是通过上调TLR4介导的。