张恩厅 布力布丽·巴哈提 朱洪涛

过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是儿童时期较为常见的一种变态反应性疾病,同时也是一种以IgA免疫复合物沉积为主的一类系统性血管炎,多发生于学龄期儿童,其中超过90%的病例发生在10岁以下,平均发病年龄为6岁,临床上主要以非血小板减少性的紫癜、肾损伤、皮肤及胃肠道受累等为主要表现,预后一般尚可,但如果未得到及时诊断与治疗,随着疾病的进展可引起肾脏损害,出现血尿、蛋白尿等表现,称为紫癜性肾炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis,HSPN),严重患者可逐步进展为肾功能不全,是HSP最严重的并发症之一,对机体健康造成巨大危害[1～3]。就目前的相关研究来说,该疾病的具体发病机制尚未十分明确,可能与感染、免疫紊乱、细胞因子分泌异常及基因多态性等方面相关[4]。研究表明,肠道微生物菌群的改变与失调也同样在HSP的发病中占据了重要地位。Zhang 等[5]研究发现,肠道菌群中的Escherichia-Shigella属对于HSP的复发具有重要的诊断价值,同时也发现链球菌和产丁酸细菌与HSP患儿消化道症状的出现相关。

SOCS-3是近年来研究发现的一类对体内多种细胞因子具有抑制作用的信号转导蛋白,主要通过影响Janus激酶/信号转导与转录激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions,JAK/STAT)信号通路发挥相应作用[6]。有研究发现,SOCS-3参与了多种肾脏疾病的发生。胡艳萍等[7]在动物实验中发现IgA肾病组外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中,SOCS-3的蛋白及mRNA表达量明显高于正常对照组,SOCS-3在肾小管和肾小球中的表达量与肾脏组织的病理损害呈负相关,推测SOCS-3可能对 IgAN肾损伤起保护作用。同时既往研究发现,SOCS-3在一定程度上与HSP的发生有一定关联,其内在机制主要可能是通过影响JAK/STAT信号通路,进而影响机体免疫应答及部分炎性介质的释放,从而产生一系列临床表现[8]。但目前国内外关于SOCS-3与HSP及HSPN的相关研究报道还相对较少,本课题通过研究SOCS-3在HSP及HSPN患儿外周血中的表达特点,探讨其表达在HSP及HSPN发病中的相关作用及其意义,为今后的临床工作提供新的思路。

资料与方法

1.研究对象：选取自2020年1月～2021年12月首次就诊于新疆医科大学第一附属医院儿科中心的无肾脏损害的HSP患儿为HSP组,其中男性16例,女性9例。收集同期近6个月内初次就诊于笔者医院被确诊为HSP并出现肾脏损害,且未接受过相关治疗的儿童25例作为HSPN组,其中男性12例,女性13例。另外选取同时期在新疆医科大学第一附属医院儿童保健科健康体检的儿童共25例作为对照组,其中男性16例,女性9例。对于所有纳入到研究中的HSP组儿童需符合2010年欧洲风湿病联盟和儿童风湿病国际研究组织和儿童风湿病联盟共同制定的HSP诊断标准。HSPN组儿童需符合中华医学会儿科学分会肾脏病学组2016年所指定的紫癜性肾炎诊治循证指南中制定的紫癜性肾炎诊断标准[9,10]。上述两组受检儿童在研究前4周内未使用过糖皮质激素、肝素及免疫抑制剂等药物,同时排除年龄>14岁、患有原发性肾小球疾病、风湿免疫性疾病及继发性肾脏疾病、严重感染、过敏性疾病、肿瘤性疾病、免疫缺陷性疾病的儿童。所纳入的对照组儿童在医院儿童保健科健康体检的儿童,且血、尿、便常规及生化、凝血等检查未见明显异常者,同时排除符合HSP及HSPN组儿童排除标准和不愿意参与研究及临床资料缺失的儿童。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理学审批号：XJBKZR20190814),研究前均取得受试对象家属知情同意并签署相关知情文件。

2.标本的采集：于入院后次日清晨空腹抽取3组儿童外周血置于肝素钠抗凝管及非肝素钠抗凝管中,每管抽血量5ml。

3.实验标本的处理：采用密度梯度离心法将肝素钠抗凝管标本分离出PBMC置于-20℃冰箱保存以备检测SOCS-3mRNA水平,同时将非肝素钠抗凝管标本离心取出血清,保存于-20℃冰箱以备后期测定SOCS-3含量。

4.SOCS-3mRNA表达水平的检测：(1)mRNA提取和cDNA的合成：DEPC处理水、50×TAE缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司;SYBR Green PCR试剂盒、mRNA荧光定量检测试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司;反转录酶购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;具体实验步骤：根据 TRIzol 试剂盒说明书的步骤提取总RNA,然后参照PCR试剂盒的方法将 RNA 反转录为 cDNA,反转录反应总体系为20μl,在0.2ml的EP管里进行。(2)SOCS-3表达量的测定：用SYBR Green PCR试剂盒检测,反应体系为50μl。以β-actin作为内参照,目的基因和内参基因的引物序列详见表1,SOCS-3、β-actin的引物设计和合成由北京擎科生物科技有限公司完成。其中 SYBR Green 25μl,cDNA 2μl,上下游引物各0.5μl,加双蒸水至50μl。PCR反应条件：95℃ 5s变性,60℃ 30min退火,共40个循环。使用2-ΔΔct方法分析数据。

表1 引物序列

结 果

1.HSP、HSPN组及对照组3组儿童在年龄性别等的一般资料分析：研究共收集25例对照组儿童,男性16例,女性9例,平均年龄为9.62±2.55岁;HSP组共25例,男性16例,女性9例,患儿平均年龄为8.20±2.57岁;HSPN组儿童25例,其中男性12例,女性13例,患儿平均年龄为9.66±2.67岁。3组儿童年龄、性别比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3组儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量的比较：对照组SOCS-3mRNA相对表达量为1.00(0.04,1.02);HSP组SOCS-3mRNA相对表达量为1.06(0.64,1.58);HSPN组SOCS-3mRNA相对表达量为1.47(1.08,2.98),且HSPN组SOCS-3mRNA相对表达量高于HSP组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。对3组儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量进行两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中HSPN组儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量较其余两组升高更显著(图1)。

图1 3组儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量的箱式图

3.HSPN组中各分型儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量的分布特点：所收集的25例紫癜性肾炎儿童分别为8例为单纯型HSP进展、11例为腹型紫癜进展、2例为关节型紫癜进展、4例为混合型紫癜进展。通过对HSPN组中各分型儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量的比较得出,HSPN组中各分型儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步通过各临床分型中的组间比较发现腹型紫癜儿童较其余几个类型外周血SOCS-3mRNA有着较高的表达量,说明腹型紫癜的儿童可能更易发生肾脏损害(表2)。

表2 HSPN组中各分型儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量的分布特点[M(Q1,Q3)]

4.50例HSP儿童各分型中外周血SOCS-3mRNA相对表达量的分布特点：各临床分型之间外周血SOCS-3mRNA相对表达量分布特点比较,差异有统计学意义(H=9.17,P<0.05)。同样,进一步通过各临床分型中的组间比较发现腹型紫癜儿童较其余几个类型外周血SOCS-3mRNA有着较高的表达量,说明腹型紫癜的儿童可能更易发生肾脏损害(表3)。

表3 50例HSP儿童各分型中外周血SOCS-3mRNA相对表达量的分布特点[M(Q1,Q3)]

讨 论

HSP又称亨-舒综合征,是临床中儿童时期最常见的血管炎之一,是一种以小血管炎为主要病理改变的全身综合征,临床主要表现为非血小板减少性可触性皮肤紫癜、伴或不伴腹痛、胃肠道出血、关节痛等症状,多呈良性自限性过程[11]。HSP患儿的预后主要取决于该病肾脏受累的程度,研究报道约1/3HSP患儿存在肾脏受累,该表现可发生于HSP的任何时期,但大多数于紫癜后1个月内出现,也可以出现于皮疹消退后或静止期[9]。同时,也有研究提到大约20%以上的儿童可在紫癜性肾炎诊断20年内进展为终末期肾病[3]。既往研究发现皮肤紫癜、消化道出血、呼吸道病原体感染、中性粒细胞与淋巴细胞比值≥6.11是HSP发生肾脏损害的危险因素,会明显增加肾脏损害发生的概率[12,13]。但由于HSP是一种系统性血管炎症,参与发病的因素众多,目前发病机制尚不十分明确,病因可能涉及免疫紊乱、遗传等多个方面,大多数研究 IgA1的异常糖基化、T淋巴细胞功能的改变以及细胞因子和炎性介质的改变在HSP的发病中发挥了重要作用[14]。

SOCS-3是SOCS蛋白家族中研究较为深入的成员之一,可以通过JAK/STAT信号通路发挥作用。SOCS-3是JAK2/STAT3信号通路的下游蛋白,可以负反馈调控STAT3通路的活化,在正常机体中SOCS-3的表达量很低或者不表达,当受到外界或自身炎症损伤等刺激时可出现过度表达现象[15,16]。SOCS3表达于Th2细胞,能够促进Th2细胞分化,抑制Th1细胞分化,增强Th2型免疫反应。CD4+的T淋巴细胞是机体参与免疫应答的重要成分,它能够在某些因素的刺激下分化成为Th1、Th2、Th17、Treg等不同的亚群,进一步参与HSP病程中毛细血管的相关炎性反应,近年来相关研究发现,HSP组患儿外周血中Th1的含量低于对照组Th2的含量高于对照组,这就说明Th1/Th2平衡向Th2的偏移与HSP的发生密切相关[17～19]。常红等[20]研究发现,在HSP中同时存在着Th17细胞的过度活化,这种现象在急性期的HSP患儿中表现尤为显著,进一步通过实验发现其可能是通过IL-6/STAT3信号异常活化所造成的,推测SOCS-3提示 HSP急性期患儿可能存在 SOCS1 和 SOCS3 表达的相对不足。杨洁等[21]研究发现,孟鲁司特作为特异性白三烯受体抑制剂可以有效调控T淋巴细胞亚群,用于HSP的临床治疗,进而缓解机体的炎性反应,降低血清中SOCS-3的水平,改善血管通透性。

Toll样受体4(Toll-like recepter 4,TLR4)作为最早在人免疫细胞发现的参与脂多糖诱导免疫反应的Toll样受体能够诱导炎性因子和细胞因子相关基因表达,参与感染性疾病、过敏性疾病等的发病。黄可等[22]研究发现,在HSP患儿中有着TLR4的高表达,其机制可能是TLR4可以通过MyD88依赖途径引起T细胞功能紊乱和多种促炎性因子失调,进而诱导辅助T细胞分化及IL6、Th17等大量炎性细胞因子的释放。

研究发现,在IgA肾病中同样存在着SOCS-3的表达增强,但与HSP及紫癜性肾炎不同的是SOCS-3的表达在IgA肾病中起着一定的保护作用,如胡艳萍[7]通过实验研究发现通过上调SOCS-3水平可以降低IgA的浓度,并可以通过TLR4的负调节作用抑制过强的炎性反应,抑制肾脏系膜细胞及基质的增生,从而达到对肾脏的保护作用。王凤英等[23]研究发现,SOCS-3的表达量在HSP患儿中明显升高,并且混合型HSP较单纯型HSP患儿的表达量增高更明显,SOCS-3表达越高的患儿越易合并皮肤外的脏器受累,提示SOCS-3表达越高者炎性反应越重,说明SOCS-3可能参与了儿童HSP的发病。本研究发现,在HSP组、HSPN组及对照组3组儿童外周血SOCS-3mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义,同时发现HSPN组SOCS-3mRNA相对表达量高于HSP组及对照组,说明SOCS-3可能参与了HSP的发病过程,并且可能进一步导致了紫癜性肾炎的发生,这一点与王凤英等[23]的研究结果相一致。

本研究发现,HSP各分型中外周血SOCS-3mRNA相对表达量比较差异无统计学意义,说明HSP单纯型、腹型、关节型及混合型及肾型几个分型中的外周血SOCS-3mRNA相对表达量并无明显差异,这一点与王凤英等[23]的研究结果不同,造成这一结果的原因可能与本研究所纳入的试验对象样本量不足所致有关,同时也不除外与实验室误差有关,后期可以通过增加更多的样本量去进行深入研究。

综上所述,HSP及紫癜性肾炎患儿中的SOCS-3表达量相对升高,并且在多种免疫相关性疾病或肾脏相关疾病中都有一定表达,后期可进一步深入探讨SOCS-3在HSP及HSPN发病过程中的分子机制及其相关影响因素,也可通过动物实验或临床研究进一步探讨SOCS-3在HSP及HSPN中各临床表型或病理分型中的表达特点,为临床中HSP及HSPN发病特点及机制提供新的研究方向。