苏苗，马若飞，李金田，2，梁建庆，魏舒畅

（甘肃中医药大学中医临床学院1，敦煌医学与转化教育部重点实验室2，基础医学院3，药学院4，甘肃 兰州 730000）

气虚为中医常见的名词术语，一般表现为形体消瘦、无力、少气、面色淡白、大便溏薄[1]等现象，是中医临床常见的证候。针对气虚症状，临床多用四君子汤等药物治疗，也有用西药进行治疗，但是运用西药具有一定的局限性，无法完全治疗气虚证症状。归芪益元膏由黄芪、当归、人参、枸杞子、熟地黄、五味子、麦冬、蜂蜜组成。黄芪、人参补气作用显著，气能生血，血能载气，当归、枸杞子等补血作用显著，共用可气血双补，对气虚小鼠具有改善作用。归芪益元膏在临床上常用于气阴两虚和气血两虚证，但关于气虚、血虚的基础研究较少。基于此，本研究采用已成熟的气虚模型建立方法-负重力竭游泳法建立气虚模型小鼠。研究归芪益元膏对气虚小鼠气虚证的改善作用，旨在为归芪益元膏的药理作用及机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种（KM）小鼠，SPF 级，6～8 周龄，体重18～22 g，雌雄各半，共50 只。由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物编号：2021-192。

1.2 药品与试剂 归芪益元膏（兰州和盛堂制药有限公司，生产批号：20200901），归芪益元膏由黄芪、当归、人参、熟地黄、五味子、蜂蜜等组成；本品为棕褐色稠厚半流体，具处方药香气，味甜，微酸；每毫升含蜂蜜药膏相当于生药0.767 g,每毫升提取浓缩液相当于生药1.66 g。根据成人临床剂量0.329 g/（kg·d）按体表系数换算为等效剂量，归芪益元膏低、中、高剂量组分别为临床给药量的5、10、20 倍。肾上腺素、去甲肾上腺素试剂盒（批号：2109M31）；肝糖原、肌糖原试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A043-1-1）；T/B 细胞检测试剂盒（批号：A10913）。

1.3 仪器 ADVIA 2120/2120i（Siemens）全自动血液分析仪[西门子医学诊断产品（上海）有限公司]；BD流式细胞仪（BD FACSCelestaTMFlow Cytometer）（SN:R66034400286）；采血管（生产批号：200711）。

1.4 药品制备 按照规定的剂量称取药材，以水为溶剂萃取2 次，首次、第2 次分别为中药材总剂量的8倍和6 倍，每次提取时长2 h。将每次提取的药物溶液合并，用300 目滤布过滤，将滤液减压浓缩后，加入制剂辅料，制备为膏剂[2]。

1.5 气虚小鼠模型建立 小鼠适应性喂养4 d 后随机分为5 组，每组10 只，称取体重并记录。除空白组外，其余各组每天在水温20 ℃、水深35 cm 的水迷宫中行负重游泳试验，于小鼠尾根部缠绕重量为该小鼠体重10%的保险丝，保证小鼠在水中不能用尾巴接触底部。以力竭为度，即小鼠四肢划动无力，身体竖立，鼻尖浸入水中5 s 不能自行浮出水面为力竭。立即将小鼠捞出，用干燥毛巾擦干鼠身。记录小鼠力竭游泳时间，1 次/d，持续30 d。模型组、空白组每天灌胃等量蒸馏水。给药量为0.2 ml/10 g。造模与给药同时进行，连续给药30 d，根据体重变化情况调整给药量，每天定时给药。

1.6 实验动物分组、给药及取材 将50 只小鼠随机分为空白组、模型组、归芪益元膏低、中、高剂量组。实验开始每天给予空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，归芪益元膏低剂量组给药归芪益元膏1.6 g/kg，中剂量组给药归芪益元膏3.3 g/kg，高剂量组给药归芪益元膏6.6 g/kg。给药量为0.1 ml/10 g。连续给药30 d，给药期间记录小鼠体重及体征变化。末次给药24 h 后股动脉取血加入EDTA 采血管中，全血采用全自动血液分析仪检测其外周血象中红细胞（RBC）、血小板（PLT）、白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）等。取脾脏、胸腺，分别称重计算脾脏指数（spleen index，SI）、胸腺指数（thymus index，TI）。取肝脏及肌肉组织，进行肝糖原、肌糖原的测定；取肾、肾上腺组织进行去甲肾上腺素及肾上腺素的测定。

1.7 证候学观察 给药及造模过程中，每3 天记录1次小鼠体重，并以小鼠耳缘、鼻唇颜色，皮毛状态，以及饮食，运动情况等作为证候学观察指标。

1.8 外周血象指标的检测[3]取全血采用全自动血液分析仪检测其外周血象中红细胞（RBC）、血小板（PLT）、白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）等。

1.9 力竭游泳时间记录[4]每天在水温20 ℃、水深35 cm 的水迷宫中行负重游泳试验，于小鼠尾根部缠绕重量为该小鼠体重10%的保险丝，保证小鼠在水中不能用尾巴接触箱底，以力竭为度（小鼠四肢划动无力，身体竖立，整个头部浸入水中5 s 不能自行浮出水面），立即将小鼠捞出，用干燥毛巾擦干鼠身，记录小鼠力竭游泳时间。

1.10 肾上腺素与去甲肾上腺素含量[5]实验结束后取材，用10%氨基甲酰乙酯（1 g/kg 或10 ml/kg 体重）经腹腔注射麻醉，迅速分离小鼠全脑，去除小脑及脑干后匀浆，4 ℃、3000 r/min 离心10 min，放置-20 ℃冰箱保存，采用ELISA 试剂盒测定小鼠脑内肾上腺素和去甲肾上腺素的含量。

1.11 免疫功能检测[6]利用细胞流式仪检测脾脏T细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+）与B 细胞（CD19+）。取小鼠脾脏研磨过100 目筛，PBS 5 ml 冲洗，收集分离的脾细胞悬液，于1000 r/min，4 ℃条件下离心5 min，弃上清；加红细胞裂解液Tris-NH4Cl 3 ml，混匀脾细胞，静置10 min，加1 ml PBS 终止裂解，于1000 r/min，4 ℃条件下离心5 min，取下面白色细胞，PBS 洗2 遍，重悬细胞，计数调整细胞浓度为1∶107/ml，进行流式细胞术检测样品T 细胞亚群与B细胞。

1.12 肝糖原、肌糖原测定[7]采用蒽酮比色法测肝糖原、肌糖原含量。造模后，为保证实验平行性，各组老鼠分批同时进行取材。用10%氨基甲酰乙酯（1 g/kg 或10 ml/kg 体重）经腹腔注射麻醉，取其肝组织和后肢肌肉各200 mg，制成10%的组织匀浆，以3000 r/min 离心5 min，取上清液以蒽酮比色法测定肝糖原和肌糖原含量。

1.13 胸腺指数、脾脏指数[8]小鼠取血后处死，取胸腺、脾脏称重，以mg/g 单位计算胸腺指数和脾脏指数。脾脏指数（SI）=脾脏质量（mg）/体重（g）；胸腺指数（TI）=胸腺质量（mg）/体重（g）。

1.14 统计学处理 用SPSS 26.0 统计软件进行组间方差分析处理。符合正态分布且方差齐时采用Oneway ANOVA 单因素方差分析，方差不齐则采用非参数检验，P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为统计学意义显著。

2 结果

2.1 各组小鼠外周血象指标的变化 与空白组比较，模型组中RBC、PLT、WBC、Hb 等含量显著降低（P＜0.01）；模型组外周血含量降低，提示其气虚模型的建立；与模型组比较，归芪益元膏低、中、高各组中RBC、PLT、WBC、Hb 含量升高（P＜0.05），见表1。

表1 药物对小鼠外周血象的影响（，n=10）

表1 药物对小鼠外周血象的影响（，n=10）

注：与空白组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 各组小鼠力竭游泳时间比较 与空白组比较，模型组小鼠力竭游泳时间缩短（P＜0.05）；与模型组比较，归芪益元膏高、中、低剂量组小鼠力竭游泳时间增加（P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠力竭游泳时间比较（，min）

表2 各组小鼠力竭游泳时间比较（，min）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

2.3 归芪益元膏对气虚小鼠肾上腺素与去甲肾上腺素含量的影响 与空白组比较，模型组小鼠肾上腺素及去甲肾上腺素浓度均有所降低（P＜0.01）；与模型组比较，归芪益元膏高、中剂量组肾上腺素及去甲肾上腺素浓度均有明显升高（P＜0.01），见表3。

表3 药物对小鼠肾上腺素和去甲肾上腺素的影响（，pg/ml）

表3 药物对小鼠肾上腺素和去甲肾上腺素的影响（，pg/ml）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01

2.4 归芪益元膏对气虚小鼠免疫细胞的影响 与空白组比较，模型组B 细胞、T 淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平均降低（P＜0.01）；与模型组比较，归芪益元膏高剂量组T 淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平均显著升高（P＜0.01），见图1。

图1 药物对小鼠B 细胞及T 细胞亚群CD4+、CD8+的影响

2.5 归芪益元膏对气虚小鼠肝糖原与肌糖原含量的影响 与空白组比较，模型组小鼠肝糖原、肌糖原含量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，归芪益元膏高、中、低剂量组大鼠肝糖原、肌糖原含量显著增加（P＜0.01），其归芪益元膏高剂量组效果最为显著，见图2、表5。

图2 药物对小鼠肝糖原、肌糖原的影响

表5 药物对小鼠肝糖原和肌糖原的影响（，mg/g）

表5 药物对小鼠肝糖原和肌糖原的影响（，mg/g）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01

2.6 归芪益元膏对气虚小鼠胸腺指数与脾脏指数的影响 与空白组比较，模型组脾脏、胸腺明显萎缩，脾脏指数、胸腺指数显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，归芪益元膏高、中、低剂量组可升高脾脏及胸腺指数（P＜0.05），见表6。

表6 药物对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（）

表6 药物对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

3 讨论

气虚证是一类以神疲乏力、少气懒言、声低息弱、自汗、动则加剧等为临床表现的虚弱证候[9]，是中医辨证论治理论体系中最重要的证候之一，其发病机制主要是元气不足，导致气的推动、温煦等基本功能或脏腑组织功能活动减退。气虚证在多数情况下仅表现为一些症状，而这些症状常不足以诊断为某一特定的疾病[10]。实验动物模型难以集中复制临床气虚各种症状与体征，仅能对气虚证部分特征性变化予以模拟重现。气虚证的动物模型主要有限制日摄食量法、泻下法、疲劳法、烟熏法等制备气虚老鼠模型。气虚最直接和客观的表现是疲劳、运动耐力、免疫力下降，而力竭游泳时间是反映运动耐力的重要指标[11]。所以本实验采用力竭游泳时间法制备气虚小鼠模型。

归芪益元膏由黄芪、当归、人参、熟地黄、五味子、蜂蜜等组成，黄芪是一味健脾益气、扶正固本的要药，在临床中应用广泛，常用于治疗气虚自汗、盗汗、浮肿、痛疽不溃或溃久不敛、脾虚泄泻及各种气衰血虚之症[12]。归芪益元膏中黄芪、当归为主，黄芪、当归配伍有助于调节物质能量代谢，调节免疫功能，发挥益气补血功用。人参更是具有大补元气之功效，诸药合用具有补气之用。

在现代气虚证候模型研究中，动物皮毛色泽、精神状态、活动情况、体质量变化、摄食饮水改变等是评价气虚动物模型的基本体表要素[13]。一般行为体征可粗略评价补气效果。本研究通过对小鼠证候学观察，结果发现模型组与空白组比较，体重下降，口唇、爪、甲颜色淡白，易脱毛，身体毛发少泽蓬松、呈淡黄色，倦怠易团缩，从中医学理论分析其证候以气虚证为主。归芪益元膏各组与模型组比较，其精神状态较好，爪甲红润，毛发柔顺，提示归芪益元膏具有补气的作用，能改善其证候学特征。

气能生血，血能载气，气能生血，是指血的组成及其生成过程中，均离不开气和气的运动变化（气化功能）。所以对于气虚小鼠，气虚则运化功能失常，则会导致血的运行也受到影响，血虚一定程度上则可反应气虚程度。研究显示[14]，气虚SD 大鼠在高、中及低切变率下全血黏度和血浆黏度高于正常组。结合患者情况，血液学指标会有不同表现，如妇科腹腔镜术后气虚证出现白细胞、中性粒细胞百分比升高,红细胞、血红蛋白、红细胞比容、血小板计数、总蛋白、白蛋白下降，红细胞沉降率明显加快。本实验进行血常规的检测，结果显示力竭游泳所致气虚模型组与空白组比较，RBC、PLT、WBC、Hb 含量均降低，与模型组相比较，归芪益元膏高、中、低剂量组可使力竭游泳所致气虚动物模型的RBC、PLT、WBC、Hb 升高。

《素问·举痛论》：“惊则心无所倚，神无所归，虑无所定，故气乱矣。劳则喘息汗出，外内皆越，故气耗矣”，对于气虚模型小鼠，力竭游泳时间是反映运动耐力的重要指标[15]。实验结果显示模型组小鼠与空白组比较游泳时间明显缩短，归芪益元膏组游泳时间与模型组相比较时间明显延长，证明力竭游泳法制备气虚模型小鼠成功，归芪益元膏组对气虚小鼠具有一定的补益作用，可改善小鼠气虚症状。

气虚则机体免疫功能下降，而胸腺、脾与机体的免疫功能密切相关。作为重要的外周免疫器官，胸腺和脾是T、B 淋巴细胞成熟、分化及免疫应答的重要场所，其体积大小是评价机体非特异性免疫的重要指标[16]。脾T 淋巴细胞亚群CD3+和CD4+主管细胞免疫，具有抗病毒和调节免疫系统功能的作用[17]。本实验采用流式细胞仪检测小鼠免疫细胞CD4+、CD8+细胞水平，对小鼠的脾脏、胸腺进行称重记录，计算其脾脏指数、胸腺指数。本实验结果表明，与空白组比较，模型组脾脏指数与胸腺指数均显著降低，B 细胞、T 淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平均显著降低；与模型组比较，归芪益元膏高剂量组T 淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平均显著升高，归芪益元膏高、中、低剂量组脾脏指数明显升高，中、高剂量组胸腺指数明显升高，表明归芪益元膏对气虚小鼠的免疫功能具有一定的调节作用，且高、中剂量组效果更佳。

糖原是生物体内能源的一种贮存形式。动物体内的能量储备包括直接能源物质（如血糖、肝糖原、肌糖原）和间接能源物质（如脂肪）等，动物以脂肪的形式储存能量可以间接作为基础代谢的能量来源[18]。在长时间大强度运动中，运动前肌糖原的储量决定达到力竭的时间，直接影响耐力训练和比赛的运动能力[19]。所以肝糖原、肌糖原的测定可以明显的看出小鼠的力竭程度及反应气虚症状。本实验结果表明，归芪益元膏高、中、低剂量组大鼠肝糖原、肌糖原含量显著增加，其归芪益元膏高剂量组效果最为显著，说明归芪益元膏对气虚小鼠肝糖原、肌糖原具有一定的调节作用，可调节其基础代谢等。

去甲肾上腺素和肾上腺素属于儿茶酚胺类物质，是由肾上腺髓质分泌的一类重要的神经递质与激素，对人体多个系统功能的调控起重要作用。气虚则会无力运化，造成全身机能的低下，实验结果表明其模型组小鼠精神状态较差，肾上腺素及去甲肾上腺素浓度值均较低，而归芪益元膏组则有所升高，证明其具有补益作用，可调节全身气化功能。

综上所述，归芪益元膏可以明显改善力竭游泳所致气虚小鼠的运化及免疫功能。本研究从药理学角度探讨归芪益元膏的补气作用，为其临床应用提供一定的科学依据。