郝煜丽,梁文文,侯喜林,王建军,胡春梅

(南京农业大学 园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京 210095)

不结球白菜(Brassicacampestrisspp.chinensisMakino),又称小白菜、油菜,是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种作物,原产中国,具有营养丰富、生长周期短、适应性强及产量高的特点,在中国及东南亚地区广泛种植,是全球栽培的重要叶菜[1],在蔬菜均衡供应中起到重要作用[2-3]。花青素是高等植物中主要的花色素[4],属于水溶性色素,在自然条件下不能稳定存在,经常与一个或多个糖苷结合形成花青苷(Anthocyanin)[5]。花青素是源自苯丙烷途径的天然黄酮类化合物[6],广泛分布于植物各组织器官中,可以使植物呈现红、紫、蓝等颜色,如紫色不结球白菜因其富含花青素而呈现紫叶性状,也因其较高的食用品质和观赏价值而受到特别赞赏[7]。

不结球白菜作为主要的鲜食蔬菜,在评判时主要从外观品质、风味品质和营养品质三方面进行考虑。其中,外观品质主要包括质量、形状、大小、色泽、病虫害情况和耐贮藏运输性等;风味品质主要是:芳香物质及质地特性;营养品质则包括维生素、蛋白质、膳食纤维、糖类、胡萝卜素和花青素含量等[8]。pH因子是植物生长发育过程中较为重要的因子,它可以从众多方面对植物的生长发育以及最终品质的形成造成影响,种植环境中pH水平的变化会对植物体内各种生理生化代谢反应产生影响,也会对色素的含量、结构和分布造成影响。相关研究表明,提高花青素的pH会使植物颜色由红色变为粉红色、紫色、蓝色、绿色和黄色[9],不同 pH 环境下植物组织提取物的颜色和花青素含量不同[10]。但在不结球白菜中关于其品质生成和花青素积累与培养液酸碱水平之间的关系尚不清楚。

本试验通过对不结球白菜施用不同pH水平的营养液培养,一段时间后测定叶片pH,光合特性、可溶性糖及可溶性蛋白含量、叶色呈现、花青素及叶绿素含量、相对酶含量等指标,以及定量分析花青素合成关键基因的表达水平,探究施用不同pH营养液对不结球白菜品质和花青素积累的影响,为不结球白菜的培育以及品质改良提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理方法

供试材料为不结球白菜,品种为紫色自交系‘紫冠’及其绿色突变体,种子由南京农业大学园艺学院白菜系统生物学实验室提供,22 ℃环境下催芽3 d,32穴盘育苗,在人工气候室中生长(光照16 h/24 ℃,黑暗8 h/24 ℃)。待长至4片真叶时移栽至小方盆基质栽培,采用1/2倍霍格兰(Hoagland)营养液定期浇灌。自第14天开始转用不同pH水平的全霍格兰营养液培养,用0.1 mol·L-1的NaOH和0.1 mol·L-1的HCl缓冲液调节营养液pH,设置4个pH水平(3.0, 5.0,7.0,9.0)处理,每4 d进行基质浇灌和叶面喷施,每盆施用200 mL。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 叶片提取液pH的测定 参考丛心黎等[11]的方法,用pH计测其pH。

1.2.2 植株光合特性 植株光合参数使用便携式光合作用测量系统(Li-6400)进行测定,采用非直角双曲线模型[12]对不结球白菜的光响应曲线进行拟合(光合有效辐射在0～1 500 μmol·m-2·s-1),再根据所拟合的光响应曲线得到各处理不结球白菜的光合参数[13]。

1.2.3 可溶性糖、可溶性蛋白含量测定 参考孔祥会等[14]的方法,分别采用蒽酮比色法测可溶性糖,考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白。

1.2.4 叶绿素含量测定 参照韦友欢等[15]的方法略有改动,采用乙醇丙酮混合液提取叶绿素,并置于440 nm、645 nm和663 nm波长下测定吸光度。

1.2.5 花青素含量测定 参照董慧杰等[16]的盐酸甲醇浸提法,配置1%的盐酸甲醇提取花青素并在530 nm和657 nm波长下测定吸光度。

1.2.6 CHI、PAL酶含量测定 PAL和CHI含量测定采用酶联免疫分析试剂盒(索莱宝提供),具体操作参考试剂盒说明书。

1.2.7 实时荧光定量 PCR 在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)设计定量引物,引物序列如表1所示。Actin作为内参引物,在 7500 实时荧光定量 PCR 仪(Applied Biosystems) 上完成定量分析。生物学重复3次,相对定量计算参照 ΔΔCT 法[17]。

表1 试验用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study

1.3 数据处理

采用Excel 2017、IBM SPSS Statistics 26.0软件进行数据处理,统计图采用Origin 2018 进行绘制,显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同pH水平对不结球白菜叶片pH的影响

对不结球白菜采用不同pH水平营养液培养一段时间,进行植株叶片提取液的酸碱度测定。图1显示,当营养液pH变化时,不结球白菜叶片提取液的pH也随之变化,在处理的14～22 d变化幅度相对较大,22 d之后pH趋于平稳,且叶片终pH的高低顺序与培养液pH水平一致。其中pH 7.0的处理组植株叶片pH变化幅度最小,终pH最接近初始值,变化最大的pH 9.0处理组。说明不同pH水平营养液对不结球白菜叶片pH的影响最小的是pH 7.0,最大的是pH 9.0。

图1 不同pH水平培养下不结球白菜的叶片组织液pH Fig.1 Leaf tissue fluid pH of non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

2.2 不同pH水平对不结球白菜光合特性的影响

各处理不结球白菜的光响应曲线变化趋势总体相似(图2)。具体表现为在较低光合有效辐射(PAR)(0～500 μmol·m-2·s-1)下,净光合速率(Pn)急剧上升;在PAR大于500 μmol·m-2·s-1后,Pn上升变慢,趋于平缓。绿色突变系(图2-B)的整体光合作用能力强于‘紫冠’(图2-A)。紫色品种中,pH 3.0处理组的光响应曲线位置最高,而pH 5.0和pH 7.0处理组光合曲线水平相近,pH 9.0水平最低,即Pn在pH 3.0水平最高,其次是pH 5.0和pH 7.0处理组,pH 9.0最低。但在绿色品种中,4条曲线高低明显,呈现为pH 5.0>pH 7.0>pH 9.0>pH 3.0,Pn也是pH 5.0>pH 7.0>pH 9.0>pH 3.0。说明紫色品种在酸性环境下(pH 3.0)光合能力最强,而绿色品种在弱酸性环境中(pH 5.0)光合能力更强,且强于紫色品种。

A.‘紫冠’;B. 绿色突变体

表2 不同pH水平培养下不结球白菜光响应特征参数Table 2 Light response characteristic parameters of non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

根据所拟合的光响应曲线得到光合参数(表2),如最大净光合速率(Pnmax)、光补偿点(LCP)、表观量子效率(AQE)以及暗呼吸速率(Rd)。拟合结果表明,绿色突变体的AQE高于‘紫冠’,说明绿色品种利用弱光的能力大于紫色品种。两品种pH 5.0和pH 7.0的AQE大于另外两处理,即pH 5.0和pH 7.0处理组植株利用弱光的能力高于其他处理。紫色品种在pH 3.0的处理下Pnmax最高,而绿色品种则是pH 5.0时Pnmax最高,且绿色品种的Pnmax都高于同处理水平紫色品种。说明紫色品种在酸性环境下光合能力更强,而绿色品种弱酸性条件下的光合能力更强且强于紫色品种。紫色品种pH 5.0处理组LCP最小,而绿色品种pH 3.0 的LCP最小,表明各自最耐阴条件为pH 5.0和 pH 3.0。

2.3 不同pH水平对不结球白菜叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

从表3可见,两叶色品种的可溶性糖含量都随pH水平由酸性至碱性变化呈现先上升后下降的趋势,且可溶性糖含量增长最多的都是pH 7.0的处理,紫叶植株每毫升提取液的可溶性糖增加了34.33 μg,绿叶品种增加了 60.62 μg;其次是pH 5.0处理组,分别增加了30.65 μg和60.03 μg,与pH 7.0处理组增长量接近,增长量最低的是pH 9.0处理。即在可溶性糖积累方面, pH 7.0>pH 5.0>pH 3.0>pH 9.0。可溶性蛋白增长量也是pH 5.0与pH 7.0处理组增长量接近且较高。说明弱酸性和中性条件(pH 5.0～pH 7.0)更有利于不结球白菜叶片可溶性糖和蛋白的积累。

表3 不同pH水平培养下不结球白菜可溶性糖和可溶性蛋白含量的变化Table 3 Change of soluble sugar and protein content in non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

2.4 不同pH水平对不结球白菜叶色呈现的影响

通过观测图3中所有处理的不结球白菜植株生长情况发现,绿色突变体(图3-B)的整体生长水平优于‘紫冠’(图3-A)。在‘紫冠’的叶色呈现中,pH 5.0和pH 7.0处理组叶片的紫色较深,pH 3.0和pH 9.0处理组紫色显著浅于其他处理,说明pH 5.0和pH 7.0培养条件更有利于紫色的呈现。而在绿色突变体中,pH 5.0处理的植株叶片绿色最深,pH 3.0次之,pH 7.0和pH 9.0最浅,说明pH 5.0的培养条件更有利于绿色的呈现。

A.‘紫冠’;B. 绿色突变体

‘紫冠’叶绿素含量变化整体小于绿色突变体(表4)。‘紫冠’在pH 5.0和pH 7.0处理下叶绿素含量增长较为明显,pH 3.0几乎无增长,pH 9.0的处理叶绿素含量有所下降。绿色突变体中,除pH 9.0外,其他处理组植株叶绿素含量都增加,其中,pH 5.0处理下增长量最多,增加了0.30 mg·mL-1,依次是pH 5.0>pH 7.0>pH 3.0。说明pH 5.0的培养条件更有利于叶绿素积累,与图3-B叶片绿色呈现规律一致。‘紫冠’花青素变化量整体高于绿色突变体(表4)。pH 5.0和pH 7.0处理组花青素总增长量显著高于其他处理,pH 5.0处理组花青素总增长量最大,说明pH 5.0的培养条件更有利于叶片花青素的积累,符合图3-A叶片紫色呈现规律。绿色突变体花青素变化规律类似但变化范围较小,因其花青素含量低于‘紫冠’。

表4 不同pH水平培养下不结球白菜叶绿素和花青素含量的变化Table 4 Changes of chlorophyll and anthocyanin content in non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

2.5 不同pH水平对不结球白菜叶片花青素合成相关酶含量的影响

探究不同pH水平处理对紫叶品种的不结球白菜叶片花青素合成通路中的关键酶含量影响,结果显示,查尔酮异构酶(CHI)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的含量均存在显著差异(图4)。但查尔酮异构酶含量在不同pH处理之间的差异比苯丙氨酸解氨酶更加明显。两种酶的相对含量都在pH 5.0处理时最高,在pH 9.0时最低。此结果与“2.4”中‘紫冠’不结球白菜叶片在不同pH水平下的花青素含量测定结果一致。

图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.6 不同pH水平对不结球白菜花青素合成关键基因的表达水平的影响

以绿色突变体在pH 3.0条件下的基因表达量为“1”得到花青素合成关键结构基因及正调控基因的相对表达量如表5。花青素合成关键结构基因BcCHS、BcCHI、BcF3H和BcDFR在两品种中表达规律大致相同,即pH 5.0处理下表达量最高,pH 9.0最低。而且花青素合成相关结构基因在弱酸环境(pH 5.0)表达总量最多。花青素合成关键正调控基因BcTT8同样是pH 5.0时表达量最高,依次是pH 5.0>pH 7.0>pH 3.0>pH 9.0,BcTTG1规律相同但总体表达量差异并不大,说明在弱酸性环境下,更有利于花青素正向调控基因(BcTT8,BcTTG1)表达,且BcTT8对pH条件更敏感。

表5 不同pH水平下不结球白菜花青素合成相关基因的相对表达量Table 5 Relative expression levels of genes related to anthocyanin synthesis in non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

3 讨 论

在蔬菜培育过程中,营养液pH往往会间接地影响蔬菜的生长和品质[18]。例如,周思婕等[19]研究发现酸胁迫可通过影响植株光合能力从而影响植物的生长和最终品质的形成,而光响应曲线可以直观地反映出植物叶片净光合速率(Pn)伴随着光合有效辐射(PAR)增减的变化规律[20]。本试验对紫叶品种的4个处理组而言,pH 3.0条件下净光合速率最大,其次是pH 5.0和pH 7.0处理水平的植株净光合速率接近,而在绿叶品种中净光合速率大小规律是pH 5.0>pH 7.0>pH 9.0>pH 3.0,这极有可能是因为不同品种的不结球白菜对酸胁迫的耐受力不同,从而对植株光合能力大小的影响也不同。紫色品种对酸胁迫的耐受力更强,而绿叶品种更倾向于弱酸性和中性环境。另外,本试验通过对可溶性糖及可溶性蛋白含量变化分析可知,弱酸性和中性营养液(pH 5.0～7.0)更有利于不结球白菜叶片可溶性糖和可溶性蛋白的积累。两个品种不结球白菜的叶绿素的总增长量都是pH 5.0>pH 7.0>pH 3.0>pH 9.0,这也与廖月[21]在多肉中的研究结果相符,即偏酸、碱性环境与弱酸性环境相比,叶绿素合成减弱。综上可知,pH水平为 5.0～7.0的环境更有利于提升不结球白菜的品质,这可能与不同pH条件下营养液中营养物质的溶解度不同和不结球白菜对营养物质的吸收转化程度不同,以及不结球白菜对酸碱水平的耐受力有关。

另外,前人研究表明,植物叶片细胞内的pH可通过影响花青素合成途径中的关键酶活性以及关键基因的表达量来影响花青素的表达,从而影响叶色呈现[22]。本试验中,不同酸碱水平培养的植株叶片组织pH与培养液高低显著相关,且叶片pH的高低顺序与培养液pH的高低顺序一致。而且在紫叶品种的不结球白菜中,pH 5.0和pH 7.0处理水平的植株紫色性状表达的更明显,pH 5.0处理组植株无论是在花青素总增长量还是CHI、PAL酶活性上都要显著高于其他处理,而且相比强酸性(pH 3.0)的环境而言,弱酸性(pH 5.0)环境更有利于紫叶不结球白菜花青素的合成,从实时荧光定量PCR结果中看花青素合成关键结构基因和正调控基因的相对表达量pH 5.0条件下表达总量最多,进一步印证了这一结论,这一结论也与袁涛等[23]研究结果相符。说明不同pH水平通过影响不结球白菜叶片的pH,进而影响花青素合成相关基因的表达以及花青素合成相关酶活性,从而调控花青素合成与积累,影响叶片的呈色,且在pH 5.0时最有利于不结球白菜的花青素积累。

综上,本试验通过对不结球白菜施用不同pH水平营养液,观测植株生长情况及叶色呈现,测定一系列生理指标以及花青素合成关键基因表达量,初步得出结论如下:不同pH水平培养液对不结球白菜品质以及花青素的积累都有显著影响。其中,pH 5.0～pH 7.0的酸碱水平在不结球白菜品质方面和白菜叶色性状呈现上都有较好的影响,弱酸性(pH 5.0)环境更利于不结球白菜花青素积累。此外,若需要得出更精确的影响规律则需要进一步精细化分处理水平以及扩大样本数量。