钱雨可,于金英,贺小如,雷秋艳,汪 冶

(1.丽水学院,浙江丽水 323000;2.浙江理工大学,杭州 310000)

松树萎蔫病(Pine wilt disease,PWD)是由松材线虫(Bursaphelenehusxylophilus)引起的松树病害,松树感染松材线虫之后,发病初期症状表现为松针的黄化和萎蔫[1],国内于1982年在南京中山陵首次发现该病[2]。在中国主要为害黑松(Pinusthunbergii)、赤松(P.densiflora)、马尾松(P.massoniana)、海岸松(P.pinaster)、火炬松(P.taeda)、黄松(P.thunberigii×P.massoniana)等松科植物。松材线虫与美国白蛾、松圆蚧一同列为森林三大病虫害,属国际重要检疫对象,其中松材线虫被林业部列为森林病虫害之首。因此,寻找能够高效杀灭松材线虫的生物防治措施、保护松属植物迫在眉睫。

植物内生菌是一类具有重要应用价值的微生物资源,微生物活性代谢产物可用来研发农药、兽药及医药。通过对微生物菌株发酵生产具有生物活性的代谢物,并将其用于病虫害的控制是目前创制生物农药的重要途径,如来自葡萄的内生真菌(Alternariaalternata)环肽类次生代谢产物对其寄主植物的病原菌(Plasmoparaviticola)有抑制作用,但对寄主植物没有毒害作用,目前被作为潜在的生物农药研究开发[3]。来自银杏的球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)的细胞松弛素类生物碱具有抗植物病原菌作用[4-5]。中国蕴藏丰富的生物资源,利用国内植物内生菌资源筛选抗虫(尤其是松材线虫)活性物质,对促进新型生物农药的开发和创制具有十分重要的意义[6-9]。植物内生真菌种类繁多,目前只有芽孢杆菌、阿姆斯特丹散囊菌和竹生炭角菌[10-11]等极少数内生生防真菌用于杀松材线虫活性的研究,难以满足大规模防治需求。本试验从八角枫科八角枫属植物八角枫(Alangiumchinense)的茎、叶组织中分离筛选具有毒杀松材线虫作用的内生真菌,并对活性高的菌株进一步进行形态特征和分子生物学鉴定,为松材线虫生物农药制剂的研究和开发提供理论依据[12]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物样本 2021年9月在浙江省丽水市白云山采集健康八角枫(Alangiumchinense)植物茎、叶组织。

1.1.2 供试线虫 松材线虫分离自丽水林区疫木。采用贝尔曼(Baermann)漏斗法对疫木中线虫进行分离,待大多数线虫怀卵后同期化处理[13],接入长满灰葡萄孢菌的培养基,28 ℃恒温培养2～3 d后得到处于L4期线虫,备用。

1.1.3 培养基 PDA培养基:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂16 g,加蒸馏水至1 000 mL,pH自然,121 ℃下灭菌20 min。

PDA液体培养基:马铃薯200 g,葡萄糖 20 g,加蒸馏水至1 000 mL,pH自然,121 ℃下灭菌20 min。

1.1.4 主要试剂 1%DMSO、乙酸乙酯、M9缓冲液(KH2PO43 g,Na2HPO46 g、NaCl 5 g, MgSO40.12 g,加蒸馏水至1 000 mL,121 ℃下灭菌20 min)、线虫裂解液(KOH 2 g,10% NaClO 10 mL,加蒸馏水至100 mL,现配现用),除乙酸乙酯为化学纯外其他试剂均为国产分析纯。

1.1.5 试验设备 TG16G离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)、KS 4000i Control恒温摇床(IKA )、SG250H超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)、R-210旋转薄膜蒸发仪(BUCHI)、旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、生化培养箱(上海森信实验仪器有限公司)、SQP电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 八角枫内生真菌分离 将八角枫植物材料用清水洗净,茎切成1～2 cm小段、叶切成 1 cm×1 cm小块,用酒精(1 min)和0.1%升汞(茎30 s、叶15 s)消毒后用无菌水清洗3次,贴于PDA培养基表面,28 ℃恒温培养4～5 d,分离、纯化单菌落。

1.2.2 发酵液及胞外代谢产物制备 待纯化真菌长满整个平板以后,切一小块(1 cm ×1 cm)长有菌丝的培养基置于PDA液体培养基中, 180 r·min-1、28 ℃培养72 h,发酵液用4层纱布过滤,取150 mL发酵液,待用。剩余发酵液加入等体积乙酸乙酯萃取胞外代谢产物,上层有机相经旋蒸浓缩,溶质用1% DMSO稀释,待用;下层水相经旋蒸浓缩,溶质用无菌水稀释,待用。将以上3部分稀释溶液分别用针筒过滤器(孔径 0.22 μm)过滤除菌,置4 ℃冰箱,备用。

1.2.3 样品制备 将各菌株发酵液稀释0、2、4、8倍,各取500 μL于24孔板中,平行3组。

各菌株有机相用1% DMSO稀释至浓度为0.062 5 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1,1 mg·mL-1,各取500 μL于24孔板中,平行3组,为样品组;阴性对照组用1% DMSO处理。水相用无菌水稀释至浓度为0.062 5 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1, 1 mg·mL-1,各取500 μL于24孔板中,平行3组。

1.2.4 杀松材线虫内生真菌筛选 采用浸渍法[14]测定各菌株代谢产物对松材线虫的毒杀作用。样品组和阴性对照组分别加入500 μL浓度为100条·mL-1的松材线虫,于28 ℃条件下放置12 h、24 h、36 h和48 h,观察线虫的存活和死亡数量,并计算死亡率与校正死亡率[15-16]。

死亡率=死虫数/供试虫数×100%

校正死亡率=(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100%

1.3 统计分析

采用Excel 2016软件整理试验数据,运用GraphPad Prism 8软件进行数据处理与单因素方差分析(One-way ANOVA),运用MEGA-X软件进行ITS序列比对与系统进化树的构建。

2 结果与分析

2.1 八角枫内生真菌形态学特征

从八角枫茎、叶组织中共分离得到11株内生真菌,编号:BZ-1～BZ-11,其中菌株BZ-8具有较好的杀线虫活性,其菌落形态特征如图1。

菌株BZ-8:菌落圆形,正面深褐色,孢子颗粒状,背面白至淡黄色。发酵液菌丝体球形,表面辐射状。

2.2 八角枫内生真菌发酵液的杀线虫活性测定结果

由表1可知,八角枫内生真菌BZ-8发酵液具有明显的杀松材线虫活性,且经过稀释后其活性仍稳定在80%以上。为确定菌株BZ-8发酵液中活性成分性质,分别对有机相和水相的杀虫活性作进一步测定与分析。

表1 BZ-8发酵液杀松材线虫毒力测定Table 1 Nematicidal activity of fermentation broth from BZ-8 against PWN

由图2可知,菌株BZ-8发酵液有机相对松材线虫具有显著毒杀作用,浓度为0.25 mg·mL-1样品经12 h处理后,平均校正死亡率达32.28%;浓度为0.5mg·mL-1样品经12 h处理后其平均校正死亡率达77.63%;浓度为1.0 mg·mL-1样品经48 h处理后其平均校正死亡率达 99.15%,具极显著杀虫活性。有机相经24 h和48 h处理后的IC50值分别为0.29 mg·mL-1、0.21 mg·mL-1(表2)。

表2 BZ-8胞外发酵产物(有机相)杀松材线虫毒力测定Table 2 Nematicidal activity of extracellular fermentation products (oganic phase) from BZ-8 against PWN

图中每个时间处理下小写英文字母不同者表示经Duncan’s法检验差异显著(P<0.05)

由图3可知,菌株BZ-8水相浓度为0.5 mg·mL-1时,经12 h处理后其杀线虫活性即可达到95%以上,平均线虫死亡率为98.92%;浓度为0.062 5 mg·mL-1的水相经12 h处理后其杀虫率达到60%以上,经48 h处理后平均线虫死亡率也可达86.34%。由此可见菌株BZ-8发酵液水相在低浓度下仍可保持其良好的杀虫活性,且经24 h和48 h处理后的IC50值分别为0.04 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1(表3),优于有机相的杀虫活性。

表3 BZ-8胞外发酵产物(水相)杀松材线虫毒力测定Table 3 Nematicidal activity of extracellular fermentation products (aqueous phase) from BZ-8 against PWN

图中每个时间处理下小写英文字母不同者表示经Duncan’s法检验差异显著(P<0.05)

2.3 内生真菌的分子生物学鉴定

ITS1引物序列:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′;ITS4引物序列:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′。PCR体系(50 μL):2×TaqMaster Mix 25 μL,ITS1引物和ITS4引物各 1 μL,gDNA 1 μL,ddH2O 22 μL。

反应程序:预变性95 ℃ 5 min;变性95 ℃ 15 s,退火50 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 40 s,循环40次。PCR产物送去上海元莘生物医药科技有限公司测序。

2.3.1 ITS序列结果 以TS1和TS4为引物对菌株BZ-8的ITS序列进行扩增,扩增结果见 图4,扩增产物片段约500 bp[17]。

图4 PCR产物凝胶电泳图Fig.4 PAGE gels of PCR products

2.3.2 系统进化树的构建 为确定菌株BZ-8的种类,下载了更多相关序列以进一步确定其种属关系。图5表明,菌株BZ8与日本曲霉Aspergillusjaponicus关系非常紧密,各自聚于同一分支[18],自展支持率为97%,结合其性状特征,鉴定菌株BZ-8为日本曲霉Aspergillusjaponicas。

图5 菌株BZ-8系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of strain BZ-8

3 讨 论

八角枫(A.chinense)作为民族用药含有酚苷、蒽醌及其苷类、生物碱类等有效成分[19],具有抗菌、抗炎、肌松、心血管系统等生理活性,可用于治疗风湿关节疼痛、心力衰竭、跌打损伤等病症[20],是目前风湿定片、风湿定胶囊、金骨莲胶囊等制剂的主药[21]。另外,八角枫也是一种有毒植物[22],八角枫生物碱可阻断神经肌肉接点的传导,引起平滑肌松弛,具有呼吸抑制、呼吸肌麻痹和中枢抑制作用[23]。一些八角枫属植物具有杀虫作用[24]。

本试验通过对八角枫枝叶内生真菌的分离纯化,得到11株内生真菌,其中一株内生菌(BZ-8)胞外发酵产物具有良好杀线虫活性,通过分子生物学鉴定为日本曲霉Aspergillusjaponicus。A.japonicus发酵液有机相经24 h处理后,其IC50为0.29 mg·mL-1,杀虫活性优于甲维盐而次于阿维菌素;A.japonicus发酵液水相经 24 h处理后其IC50为0.04 mg·mL-1,说明其杀虫活性成分存在于水相中,为水溶性物质,且活性明显优于阿维菌素[25]。

何琼等[26]研究发现,日本曲霉(A.japonicus)发酵液经24 h处理后对2龄南方根结线虫幼虫的校正死亡率达到100%,且具有优良稳定性。吴海燕[27]发现A.japonicus发酵滤液5倍稀释液的杀线虫率可于6 h内达到100%,且近50%的线虫虫体被降解,8 h近90%的线虫被降解。证实该菌株次生代谢产物具有明显的杀线虫活性,可用于线虫的生物防治,具有作为一种新型杀线剂的开发潜力。

本试验针对八角枫内生真菌日本曲霉A.japonicus的胞外发酵液毒杀松材线虫作用进行初步研究,还需要对胞外发酵液的有机相和水相杀虫活性部位进一步分离纯化,以发现活性先导化合物。并对杀虫活性成分的毒杀松材线虫的作用机制进行深入研究。