李昕冉,景 涛,孙晨曦,郭彩苹,马耀杰,徐秉良,张树武

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070)

立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)不仅作为危害黄瓜(Cucumissativus)的重要病原菌之一,还可危害水稻(Oryzasativa)[1]、玉米(Zeamays)[2]、棉花(Gossypiumspp.)[3]和辣椒(Capsicumannuum)[4]等,并且具有侵染力强,侵染后发病周期短、蔓延快和毁灭性强等特点,危害严重时可造成作物田幼苗成片死亡,严重减产和降低品质[5]。目前,黄瓜立枯病的防治主要通过使用杀菌剂进行育苗土处理和种子消毒,但是长期大量施用杀菌剂,不仅导致病原菌产生抗药性,而且导致药剂残留,造成污染环境和恶化土壤等弊端[6]。因此,鉴于化学农药防治的局限性和蔬菜绿色生产的要求,生物防治已成为国内外植物病害防治的热点之一。

木霉(Trichodermaspp.)是一类对多种植物病原菌具有较好拮抗作用的生防真菌,可作为农作物病害生物防治的重要组分,具有重要研究价值和广阔应用前景[7]。前期研究发现,木霉的生防机制主要有竞争作用、寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性等[8],并具有促进植物营养吸收、生长、根系发育,降低病害发生等特点[9]。王子晴等[10]研究发现多种木霉对细辛核盘菌(Sclerotiniaasari)的抑菌率均大于90%。王天君[11]研究发现多种木霉与立枯丝核菌对峙试验中拮抗指数可达1级。尤佳琪等[12]研究发现拟康宁木霉(T.koningiopsis)发酵液对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的生长抑制活性达52.1%。此外,申君等[13]研究发现木霉对番茄(Lycopersiconesculentum)、茄子(Solanummelongena)、辣椒(Capsicumannuum)、白菜(Brassicapekinensis)等蔬菜病害的病原菌均具有抑制作用。

本试验以具有自主知识产权的长枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T6为供试菌株,通过对峙培养法、含药培养基法和显微观察法,测定长枝木霉菌株T6及其代谢产物对立枯丝核菌的抑制活性及其作用机制进行初步研究,旨在为高效微生物型杀菌剂开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 长枝木霉(T.longibrachiatum)菌株T6和立枯丝核菌(R.solani)均由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室分离 保存。

1.1.2 代谢产物 长枝木霉菌株T6代谢产物由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室分离保存。

1.2 试验方法

1.2.1 长枝木霉菌株T6活化及其分生孢子悬浮液制备 将4 ℃低温保存的长枝木霉菌株T6接种于固体PDA培养基上进行活化培养,培养 6 d后加入5 mL无菌水和50 μL Tween-80于布满大量分生孢子的菌落表面,充分洗脱和混匀后转入无菌离心管,获得其分生孢子悬浮液原液。使用血球计数板测定原液浓度并利用无菌水稀释至1.0×107cfu·mL-1,保存至4 ℃,备用。

1.2.2 长枝木霉菌株T6发酵液制备 参考王子晴等[10]的方法,将制备好的长枝木霉菌株T6分生孢子悬浮液(1.0×107cfu·mL-1)接种于装有60 mL发酵液培养基(甘露醇40 g,蛋白胨 1 g,水1 L)的三角瓶(150 mL)中,并置于160 r·min-1摇床(ZQLY-180N,上海知楚仪器有限公司)中摇培5 d。利用无菌滤纸滤除菌丝,置于低温离心机(NP-N1-16KR,宁波北角生物科技有限公司)4 ℃下离心20 min,弃去沉淀并吸取上清液经无菌微孔滤膜(直径0.22 μm,北京索莱宝科技有限公司)过滤,即获得发酵液原液,于4 ℃保存,备用。

1.2.3 抑菌活性测定及重寄生作用观察 采用对峙培养法和生长速率法测定长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌的生长抑制活性。利用灭菌的打孔器(d=0.5 cm)制备长枝木霉菌株T6和立枯丝核菌的菌饼,并分别将其菌饼正面朝下对峙接种于制备好的PDA平板,立枯丝核菌按照同样方法接种于PDA平板中央作为对照。接种培养皿置于25 ℃和16 h光照人工气候箱(HQH-H300,上海跃进医疗器械有限公司)中培养,每天观察并记录长枝木霉菌株T6和立枯丝核菌的对峙生长,于接种后第4 天测量各处理和对照菌落直径,每天测定1次,试验组每个处理和对照组均设3次重复。根据下列公式计算长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌的生长抑制率。

生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径) /(对照菌落直径-0.5)×100%

1.2.4 长枝木霉菌株T6发酵液抑菌活性测定 取制备好的长枝木霉菌株T6发酵液、发酵液体培养基、无菌水各6 mL分别加入60 mL PDA培养基中,摇匀后分别倒入3个培养皿(85 mm)中制成平板。试验以发酵液体培养基和无菌水分别作为阳性对照和阴性对照。利用打孔器(d=0.5 cm)在活化的立枯丝核菌菌落边缘打取菌饼,将其菌饼正面朝下接种于制备好的各处理组和对照的PDA平板中央,置于25 ℃光照培养箱(HQH-H300,上海跃进医疗器械有限公司)中培养,于培养4 d后采用“十字交叉法”测量菌落直径,按“1.2.3”中公式计算其生长抑制率。每个处理和对照均设3次重复。

1.2.5 长枝木霉菌株T6代谢产物提取及其活性测定 将提取保存的长枝木霉菌株T6代谢产物利用丙酮进行溶解,溶解后利用无菌水依次稀释梯度浓度为200、300、400、500、600 μg·mL-1进行抑菌活性测定,试验分别以稀释等浓度丙酮作为阳性对照,以无菌水作为阴性对照,参照上述方法测定其抑菌活性。同时,以代谢产物浓度对数值(x)与抑制率几率值(y)之间的线性回归关系,依据y=ax+b求出毒力回归方程和EC50值。

1.3 数据分析

采用 Microsoft Excel 2016进行数据整理和分析,并采用SPSS 20.0软件(IBM,美国)进行显著性分析和Duncan氏新复极差法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌抑菌活性及其重寄生作用

由图1和表1结果表明,长枝木霉菌株T6不仅对立枯丝核菌的营养生长具有显著的抑制作用,而且对其菌丝具有明显的重寄生作用(表1;图1-D～F)。接种后4 d和5 d时,长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌的菌落生长抑制率分别为 57.82%和66.50%(表1)。接种后5 d时,立枯丝核菌的菌落呈半圆形,生长抑制显著(图1-A),而对照则生长正常(图1-B)。同时,长枝木霉菌株T6和立枯丝核菌菌落相互接触(图1-C),显微镜观察发现其在接触部位出现长枝木霉菌株T6菌丝缠绕和重寄生于立枯丝核菌菌丝表面(图1-D～F)。因此,长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌具有显著的抑制和重寄生作用。

表1 长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌的生长抑制率Table 1 Growth inhibition rate of Trichoderma longibrachiatum isolate T6 against Rhizoctonia solani

A.T6+立枯丝核菌;B.对照;C.T6与立枯丝核菌的菌丝接触;D、E、F.T6菌丝缠绕和重寄生于立枯丝核菌

2.2 长枝木霉菌株T6发酵液抑菌活性

与对照相比,长枝木霉菌株T6发酵液对立枯丝核菌具有较强的抑菌效果。处理后第4天,长枝木霉菌株T6发酵液处理的菌落直径(图2-A)均显著小于阳性对照(图2-B)和阴性对照(图2-C)的菌落直径,长枝木霉菌株T6发酵液对立枯丝核菌生长抑制率为72.29%。因此,长枝木霉菌株T6发酵液对立枯丝核菌具有显著抑制 作用。

A.发酵液; B.阳性对照; C. 阴性对照

2.3 长枝木霉菌株T6代谢产物抑菌活性

与对照相比,长枝木霉菌株T6代谢产物对立枯丝核菌具有显著的抑制作用,其抑菌作用随着长枝木霉菌株T6代谢产物的浓度增加逐渐增强,不同浓度之间的抑菌作用存在显著差异。质量浓度为600 μg·mL-1的长枝木霉菌株T6代谢产物抑菌效果最佳,培养第4天时立枯丝核菌菌落最小(图3-A),质量浓度为500 μg·mL-1(图3-B)、400 μg·mL-1(图3-C)和300 μg·mL-1(图3-D)的菌落次之,质量浓度200 μg·mL-1的菌落最大(图3-E),而阳性(图3-G)和阴性(图3-F)对照菌落生长均满皿。待培养第4天时,质量浓度为600 μg·mL-1的菌株T6代谢产物对立枯丝核菌的生长抑制率为 71.91%,EC50值为174.83 μg·mL-1(表2)。500、400和300 μg·mL-1的长枝木霉菌株T6代谢产物抑菌率次之,但均大于60%,而质量浓度为200 μg·mL-1时抑菌率较低,为52.32%。因此,不同浓度长枝木霉菌株T6代谢产物对立枯丝核菌具有显著的抑制作用。

表2 长枝木霉菌株T6代谢产物对立枯丝核菌的抑制作用Table 2 Inhibition effect of Trichoderma longibrachiatum isolate T6 metabolites on Rhizoctonia solani

A. 600 μg·mL-1;B. 500 μg·mL-1;C. 400 μg·mL-1 ;D. 300 μg·mL-1;E. 200 μg·mL-1;F. 阴性对照 Negative control; G.阳性对照 Positive control

3 讨论与结论

陈立华等[14]报道棘孢木霉(T.asperellum)发酵液对立枯丝核菌的菌核萌发及菌丝干质量均表现出明显的抑制作用。咸洪泉等[15]研究发现木霉菌株的代谢产物可以抑制立枯丝核菌的菌丝生长及菌核的形成和萌发。彭丽娟等[16]研究发现绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)均对立枯丝核菌的菌丝生长产生抑制作用。本试验发现长枝木霉菌株T6对立枯丝核菌菌落生长具有显著的抑制作用,对峙培养第5天时其对立枯丝核菌生长抑制率高达66.46%。

另外,本试验显微镜观察发现,在长枝木霉菌株T6和立枯丝核菌接触处,菌株T6菌丝能够缠绕和寄生于立枯丝核菌菌丝表面。夏伟等[17]研究认为棘孢木霉发酵液处理的立枯丝核菌菌丝会出现变形和细胞质浓缩。高苇等[18]研究发现绿色木霉可使立枯丝核菌细胞壁变薄、消解和菌丝破裂。史凤玉等[19]光学显微镜下观察到长枝木霉菌丝能够缠绕和侵入立枯丝核菌菌丝,并导致立枯丝核菌细胞质变薄、消解和断裂等。田连生等[20]通过显微镜观察发现绿色木霉与立枯丝核菌的菌丝交接处,绿色木霉菌丝能够重寄生于立枯丝核菌菌丝,并吸取其菌丝营养使得病菌营养菌丝失活、气生菌丝逐渐消亡、解体。

Druzhinina等[7]发现木霉不仅能够对植物病原真菌具有重寄生作用,而且可以通过分泌细胞壁降解酶、抗菌活性产物、诱导植物产生抗性等机制有效防治多种植物病害。张慧等[21]证实木霉能够产生丰富的次生代谢物,具有抑制病原菌和促进植物生长等功效,在农业和医药领域有广泛应用。Zhang等[22]发现长枝木霉菌株T6发酵液和次生代谢产物对苹果树腐烂病菌(Valsamali)菌落生长具有抑制作用,而本研究发现长枝木霉菌株T6发酵液和代谢产物对立枯丝核菌的生长具有显著的抑制作用,而且抑菌效果随着代谢物浓度升高而增强,质量浓度为600 μg·mL-1的菌株T6代谢产物对立枯丝核菌的生长抑制率为 71.92%,研究结果为后续木霉生物菌剂及种衣剂应用于植物病害防治具有广泛的应用前景,但是有关其拮抗作用机制尚待进一步研究。