俞才兰,李文亮,张 洁,宋丽雯

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070)

截形叶螨(Tetranychustruncatus)属蛛形纲(Arachnida)叶螨科(Tetranychidae)。其在甘肃河西地区主要为害玉米,由于该地区昼夜温差大,气候干旱,玉米种植面积大,导致该地区截形叶螨增长迅速,已成为玉米害螨的优势种,对杂交制种试验田中玉米的产量和质量造成严重影响[1-2]。叶螨主要集聚于叶片的背部通过吮吸汁液对作物产生为害,初期叶片上会出现小白斑,为害后期会使寄主植株枯萎甚至死亡[3-4]。

温度是影响昆虫生存、生长、繁殖、发育和传播的重要因素之一[5-6]。高温会加快昆虫个体发育,缩短世代历期,降低昆虫繁殖力[7]。此外,高温也会改变昆虫种群动态,降低物种丰富度以及昆虫的存活率,可以通过向高纬度地区迁移扩张来应对温度的变化[8]。高温直接或间接影响昆虫的所有生理过程,通过调整自身的免疫调节途径或一些酶类来应对逆境胁迫,包括热激蛋白的上调表达以及过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)等抗氧化酶含量的变化[8-11]。目前,在全球气候变暖的大背景下,极端高温天气出现的频率显著增加。因此,昆虫对高温的耐受性及其机理已经成为近年来昆虫学研究领域中深受重视的问题。

目前,关于温度对于截形叶螨影响的研究大多集中在生态学和生理生化方面,甘肃农业大学农作物病虫害生物防治工程实验室前期研究也证明高温胁迫对叶螨的生长、发育和繁殖造成了一定的影响,并且引起了体内蛋白、保护酶等含量的变化[12-14]。且由于截形叶螨目前尚未公布基因组图谱。因此,本研究采用转录组测序的方法,分析截形叶螨雌成螨应对热胁迫的差异表达基因主要功能类群及相关代谢通路,挖掘潜在的与截形叶螨热胁迫相关基因,可为后续截形叶螨热胁迫相关基因的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试叶螨

截形叶螨(Tt-S):采集于未施任何农药的玉米田,在甘肃农业大学农作物病虫害生物防治工程实验室室温条件下采用雌(体椭圆形,红色,体躯两侧有两对黑斑,腹部末端呈钝角)雄(体类似棱形,比雌螨小,淡红色,腹部末端呈锐角)单系(一雌一雄在饲养台上饲养)饲养扩繁,饲养扩繁2个月后,将叶螨转移至已提前种好的豇豆幼苗上饲养80代以上,饲养期间叶螨不接触任何药剂,以保证其具有较高敏感性。

1.2 供试试剂和仪器

试剂:Trizol,美国Invitrogen公司;NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒,近岸蛋白质科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司。

仪器:普通T100TMPCR仪,美国伯乐(Bio-Rad)公司;ABI Q5荧光定量PCR仪,美国Applied Bio systems(ABI)公司;NanoPhotometer-N50微量分光光度计,德国Implen公司;B-60S制冰机,太仓市华利达实验设备有限公司。

1.3 叶螨处理

挑取2～3日龄截形叶螨雌成螨200头于饲养台,置于40 ℃下处理1 h,记做Tt-MH-S,将处理后存活的叶螨收集到无酶(RNase)离心管,对照为25 ℃下饲养的截形叶螨雌成螨(Tt-S),每个处理设置4个重复,共计8个样品。将收集好的样品用液氮冷冻后在―80 ℃的冰箱中保存。

1.4 Illumina测序与分析

1.4.1 cDNA文库构建与测序 将“1.3”收集到的样品送至广州基迪奥生物科技有限公司(广州)进行测序,cDNA文库的构建及上机测序由该公司完成,测序平台为Illumina HiSeq 4000。

1.4.2 差异表达基因功能分析和通路富集分析 由Illumina平台测序得到原始图像数据,经过碱基识别(base calling)转化为序列数据(raw data),对下机得到的raw data利用fastp软件进行质控,过滤低质量数据,获得高质量过滤数据(clean data)。再与前期已测得的截形叶螨三代转录组数据(由卵和各螨态雌、雄螨组成的混合样品经测序平台Pacbio测序技术得到)进行转录本的校正,并对其进行FPKM(基因转录的每千碱基片段数/百万片段测序)转换。使用DESeq2软件进行统计分析,获得高温处理截形叶螨雌成螨的差异表达基因集。基于差异分析结果,筛选FDR(错误发现率)<0.05且差异倍数 |log2FC|>2的基因为显著差异基因(DEGs),并对差异基因集进行GO(Gene Ontology)功能富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。

1.5 RT-qPCR验证测序结果

1.5.1 cDNA的合成 用Trizol法提取总RNA,每个样品雌成螨约150头,具体方法参照文献[15]。取少量RNA在超微量分光光度仪进行浓度测定后,根据宝生物PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录RNA合成第一链cDNA,在-20 ℃下保存。

1.5.2 候选基因的引物设计 为检验测序结果的可靠性与准确性,根据转录组测序数据选取21个差异基因进行荧光定量验证。根据筛选出基因的序列,利用Primer 6设计出相应的定量引物。内参基因选用RPS18[16]和Actin[17]。引物序列设计如表1所示,合成由广州擎科生物技术有限公司完成。

表1 截形叶螨qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR for Tetranychus truncatus

1.5.3 RT-qPCR反应 采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒在ABI Q5荧光定量PCR仪中进行RT-qPCR反应。具体反应体系与程序参照文献[15]。

1.6 数据分析

基因的相对表达量采用2-△△CT方法进行计算和分析[18]。采用Origin 2018软件和SPSS 23软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 转录组质量测序评估

截形叶螨雌成螨在热胁迫下的转录组数据如表2所示,共得到高质量过滤碱基(Clean bases)约为52.94 Gb,其中各样本的高质量过滤碱基(Clean bases)均超过6.86 Gb。过滤后各样本读数(reads)占比均超过各自原始reads的99%;序列的质量参数Q20(质量值达到20的碱基所占百分比)百分比大于97%,Q30(质量值达到30的碱基所占百分比)百分比大于92%,过滤后的碱基GC含量(碱基G和C的总和占总碱基数的百分比)大于38%。全部可以比对到参考基因上的读数占有效reads的百分比均超过93%。说明此次测序组装结果比较可靠,可用于后续试验分析。

表2 转录组测序数据质量评估Table 2 Quality evaluation of transcriptome sequencing

2.2 差异表达基因分析

2.2.1 截形叶螨热胁迫下的差异表达基因 对高温和室温处理下截形叶螨雌成螨的DEGs进行火山图分析(图1)。发现相比对照,截形叶螨雌成螨高温胁迫后,共有17 577个基因的转录水平发生了变化,其中12 831个基因表现为上调, 4 746个基因表现为下调。

红色表示高温胁迫上调表达的差异基因;蓝色表示高温胁迫下调表达的差异基因(判断标准为 FDR<0.05, 且差异倍数两倍以上),绿色表示没有差异

2.2.2 差异表达基因的GO功能分析 截形叶螨雌成螨经热胁迫后DEGs的GO富集分析如图2所示,这些差异表达基因主要被注释到生物学过程(Biological process)、细胞成分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)3个类别的56个GO terms中,其中参与分子功能的7 481个差异基因注释到12个terms中,主要在催化活性(Catalytic activity)以及结合(Binding)等功能显著富集;参与细胞组分的6 017个差异基因注释到20个terms中,显著富集在细胞(Cell)、细胞组分(Cell part)和细胞器(Organelle)中;参与生物学过程的8 174个差异基因注释到24个terms中。主要参与细胞过程(Cellular process)、单一生物过程(Single-organism process)、代谢过程(Metabolic process)、生物调节(Biological regulation)和发育过程(Developmental process)等生物学过程。

1.细胞过程;2.单一生物过程;3.代谢过程;4.生物调节;5.发育过程;6.生物过程调控;7多细胞有机过程;8.细胞组分组织或生物发生;9刺激响应;10.细胞内定位;11.信号;12.繁殖;13.繁殖过程;14.多有机体过程;15.生物过程的负调控;16.运动;17.生物过程调控;18.习性;19.生长;20.生物附着;21.免疫系统过程;22.节律过程;23.参与突触传递的突触前过程;24.生物阶段;25.细胞;26.细胞组分;27.细胞器;28.大分子配合物;29.膜;30.细胞器组分;31.膜组分;32.膜封闭腔;33.细胞结合;34.胞外区域;35.胞外区域组分;36.突触;37.突触组分;38.超分子纤维;39.病毒体;40.病毒组分;41.细胞外基质;42.其他有机体;43.其他有机体组分;44.细胞外基质成分;45.催化活性;46.结合;47.转运活性;48.核酸结合转录因子活性;49.信号传感器活动;50.分子转导活性;51.分子功能调节剂;52.结构分子活性;53.转录因子活性,蛋白质结合;54.抗氧化活性;55.翻译调节活性;56.电子载体活性。横坐标为二级GO term,纵坐标为该term里的基因数量,红色表示上调,绿色表示下调

2.2.3 差异表达基因的KEGG通路富集 对差异基因进行KEGG分析,发现共有5 882个DEGs被注释到144条通路,图3为富集显著的前20条通路,差异表达基因在代谢途径(Metabolic pathways,2 146条基因)、溶酶体(Lysosome,598条基因)、碳代谢(Carbon metabolism,335条基因)、脂肪酸代谢(Fatty acid metabolism,257条基因)、氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids 207条基因)和氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,204条基因)等6条通路显著富集。

纵坐标表示差异显著前20通路;横坐标为富集因子(该通路中差异基因除以所有数量);大小表示数量多少,颜色越红Q值越小

2.2.4 RT-qPCR验证测序结果 本研究对转录组测序结果中13条上调表达的基因和8条下调表达的基因(图4)进行RT-qPCR验证,结果表明,12条基因上调表达,5条基因下调表达(图5)。即截形叶螨雌成螨热胁迫后有17条基因的RT-qPCR结果与转录组测序结果一致,表明转录组测序结果可靠。

图4 截形叶螨差异基因在RNA-Seq中的表达量Fig.4 Relative expression of T.truncatus in RNA-Seq

*表示基因差异显著(P<0.05);**表示基因差异极显著(P<0.01)

3 讨论与结论

本研究对热胁迫下的截形叶螨雌成螨进行转录组测序和差异表达基因分析,GO功能富集发现这些DEGs主要在细胞过程(Cellular process)、单生物过程(Single-organism process)、代谢过程(Metabolic process)催化活性(Catalytic activity)和细胞(Cell)中富集,这些富集注释主要与细胞分化(cell differentiation)、生殖发育(Reproductive development)、细胞组成(Cell composition)、蛋白质的分泌和摄入(Protein secretion and intake)以及酶的合成和代谢(Synthesis and metabolism of enzymes)等有关。因此推测叶螨可能通过能量代谢及其代谢产物来应对温度胁迫。Li等[19]研究发现,当昆虫受到热应激时,大多数蛋白质的合成会减少。KEGG分析发现,差异基因主要富集在代谢途径(Metabolic pathways)和溶酶体(Lysosome)等通路。Vatanparast等[20]对高温胁迫秋粘虫后差异基因的研究发现,秋粘虫的DEGs通常在与能量代谢相关的途径中积累,且许多代谢过程基因的转录在高温环境下受到抑制。Ran等[21]发现氨基酸合成代谢上调,产生大量氨基酸,为耐热蛋白的合成提供原料。本研究结果也表明高温胁迫下DEGs在叶螨各种能量代谢的途径中富集,其体内脂肪酸代谢合成途径的表达响应高温而上调。

有关研究发现抗氧化酶是保护昆虫免受高温胁迫的一类重要酶系。如程杰[5]研究发现高温会引起昆虫的氧化应激反应,昆虫会产生CAT、SOD和POD等抗氧化酶来消除活性氧的影响。崔娟等[22]研究发现抗氧化酶在昆虫抵御高温胁迫的过程中发挥着重要作用,筛豆龟蝽(Megacoptacribraria)成虫可有效抵御热胁迫诱导的活性氧,进而表现出对高温较强的适应性。本研究发现截形叶螨雌成螨在热胁迫后,体内抗氧化酶基因均显著上调表达,推测抗氧化酶基因在截形叶螨应对高温胁迫时发挥着重要的作用。

此外,热激蛋白作为一类分子伴侣,也是昆虫响应高温胁迫的重要组成部分。朱宇等[8]发现二化螟(Chilosuppressalis)热激蛋白Hsp70、热激蛋白Hsp90和小分子热激蛋白能够提高二化螟幼虫对高温的适应性。宋杰[9]研究结果显示,在42 ℃持续高温胁迫下,二化螟热休克转录因子蛋白基因的相对表达量会显著上调,以抵消高温对自身造成的影响。杨丽红[23]研究发现柑橘全爪螨(Panonychuscitri)的PcHsp90和PcHsp70基因在抵御高温胁迫方面发挥着重要作用。本研究结果显示,截形叶螨雌成螨热胁迫后,热激蛋白基因的表达量发生了变化,推测热激蛋白可能在截形叶螨雌成螨应对热胁迫时也发挥了作用。

综上所述,截形叶螨雌成螨可能从能量代谢、抗氧化防御、分子伴侣等多方面应对高温胁迫,因此,后期可采用RT-qPCR和RNA干扰相结合的方法筛选对热胁迫相关重要基因进行功能分析和验证,为揭示截形叶螨耐热机制奠定一定的基础。