曹文洁, 许 毛, 余惠凡,3, 刘 丽, 钱永帅, 李 飞△

湖北医药学院1药学院2武当特色中药研究湖北省重点实验室3生物医药研究院,十堰 442000

中性粒细胞是第1个被招募至机体病原感染和组织损伤部位的细胞效应器,在炎症、免疫细胞募集、病原体清除和组织修复中发挥重要作用,主要通过吞噬、脱颗粒、生成细胞因子和中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成等4种机制执行其功能[1]。近年来,大量研究表明NETs参与了肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)[2]、糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)[3]、狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)[4]等多种肾脏疾病的病理生理过程,本文通过综述NETs在肾脏疾病中的最新研究进展,为肾脏疾病的诊疗提供新的思路。

1 NETs概述

作为一种纤维网络状结构,NETs在2004年首次被发现参与捕获并杀灭病原体,在机体受到细菌、病毒等病原微生物刺激时由中性粒细胞活化后产生,主要以解聚的染色质DNA为骨架和多种蛋白质颗粒结合组成。蛋白颗粒主要包括组织蛋白酶G(cathepsin G,CG)、瓜氨酸化组蛋白(citrullinated histone H3,CitH3)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等30多种活性蛋白[5]。CitH3是组蛋白H3中肽酰精氨酸转化为瓜氨酸的产物,高度参与NETs的形成过程。NETs作为一种天然屏障,可有效捕获并杀灭病原体,然而形成过多或清除异常会引发机体功能障碍,导致组织器官损伤和疾病的发生,如自身免疫性疾病、癌症和血栓[6]。故NETs被认为是多种疾病的潜在致病因素。

2 NETs的形成机制

NETs的形成过程被称为NETosis,是一种不同于凋亡和细胞坏死的特殊细胞死亡方式,也是一种全新的细胞免疫应答方式[7]。研究表明,细菌、LPS、干扰素、缺氧、血小板、自身抗体等均可刺激中性粒细胞产生NETs,激活中性粒细胞后,肽基精氨酸脱亚氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)通过诱导组蛋白瓜氨酸化,使其强正电荷降低从而弱化DNA和组蛋白的结合,紧接着核膜和颗粒膜消失,NE转移至细胞核并作用于组蛋白使染色质解聚,瓜氨酸化的组蛋白、解聚后的DNA及颗粒蛋白在细胞质内合成NETs,最后被排出细胞外[5](图1)。

图1 NETs的生成Fig.1 NETs formation

NETs的形成机制分为两种,经典途径依赖于NADPH氧化酶产生的ROS,细胞膜破裂后染色质DNA及相关蛋白质释放至细胞外,导致中性粒细胞死亡[8];此外,有研究发现线粒体DNA(mitochondrial,mtDNA)释放可导致80%的中性粒细胞在15 min内通过识别补体因子5a或LPS形成NETs[9]。非经典途径是在中性粒细胞膜完整的情况下,染色质以囊泡出芽的方式被排出细胞,细胞膜重新闭合,形成的无核中性粒细胞继续行使其趋向性及吞噬作用等职能[10]。无ROS参与的NETs形成过程是一种NETosis的特殊途径,其具体机制和生理意义还有待阐明。

3 NETs与急性肾损伤

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是肾脏疾病患者死亡的常见原因,病理表现通常包括肾小管受损、肾血管功能失调、过度炎症和免疫细胞浸润[11]。最新研究表明,NETs参与了肾脏缺血再灌注损伤、溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,HUS)和脓毒症引起的AKI发病进程[2,12-13]。

3.1 肾缺血再灌注损伤

缺血再灌注(I/R)是AKI最常见的原因之一,可引发介导肾细胞坏死、凋亡、炎症和纤维化的信号级联反应[14]。肾缺血后大量肾小管上皮细胞坏死或凋亡,坏死细胞具有高度的免疫刺激性,它们会导致细胞中核成分的释放,如DNA、组蛋白和促炎分子HMGB1溢出到细胞外,从而触发炎症,进一步加剧组织缺血和损伤。组蛋白瓜氨酸化及DNA外溢是NETs形成的关键步骤[15]。

研究发现,IRI大鼠肾组织中MPO、CitH3表达显著增加,血清SOD活性降低,且肾组织中Bax mRNA水平显著升高,Bcl-2 mRNA水平降低,而脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonucleaseⅠ,DNaseⅠ)干预后NETs含量明显降低,表明DNaseⅠ预处理可通过抑制细胞凋亡减轻肾脏IRI,提示NETs介导了肾I/R导致的组织损伤[2]。进一步研究发现,小鼠肾脏IRI使紧邻坏死细胞管型的血小板活化增加,血小板-粒细胞相互作用并形成NETs,而氯吡格雷可通过抑制血小板生成而减少细胞坏死和炎症,且抑制了NETs生成[16]。另有研究发现,肾I/R后,PAD4在浸润的白细胞中高度表达,并伴随着组蛋白H3的瓜氨酸化和小鼠肾脏中NETs的形成;而PAD4缺陷小鼠肾脏中未形成NETs,促炎因子表达较低,肾IR诱导的AKI损伤较轻;DNaseⅠ或PAD4特异性抑制剂YW3-56可改善野生型小鼠肾I/R诱导的AKI[15]。

在AKI期间,中性粒细胞首先浸润肾间质,有研究发现补体C3敲除后小鼠I/R肾损伤减轻,且中性粒细胞浸润和NETs生成减少,PAD4抑制剂GSK484也可减少NETs的释放;在体外,C3a可诱导NETs形成,CitH3和MPO共定位于细胞外DNA结构上[17]。以上结果表明,C3缺乏可通过减少中性粒细胞浸润和NETs形成改善AKI,靶向C3激活可能是缓解AKI中NETs坏死性炎症的治疗新策略。

3.2 溶血性尿毒症综合征(HUS)

HUS主要由大肠埃希菌产生的志贺毒素(Stx)感染引起,是一种以微血管性溶血、血小板减少和急性肾衰竭为特征的血管疾病。研究表明,HUS患者血浆中循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)和核小体的含量与健康人相比更高,且HUS患者的中性粒细胞自发性NETosis能力更强;另外,Stx可在健康人中性粒细胞中诱发NETosis,在HUS期间,NETs可导致微血管系统炎症反应发生和血栓形成,从而诱发肾功能衰竭[18]。最新研究发现,Stx2a可通过NADPH氧化酶依赖性途径以剂量依赖性方式诱导人中性粒细胞释放NETs并产生ROS,且急性期HUS患者的中性粒细胞更容易通过此途径发生自发性NETosis[19]。研究表明,LPS和Stx2处理血小板后,通过DNaseⅠ降解NETs或使用抗P-选择素抗体阻碍中性粒细胞-血小板聚集体形成可减少NETs介导的内皮细胞损伤;将LPS和Stx2注射到血小板耗尽的小鼠中,DNA-组蛋白和DNA-弹性蛋白酶复合物水平降低,全身内皮损伤/功能障碍减少,表明减少中性粒细胞-血小板聚集体或NETs形成可缓解HUS诱导的内皮损伤[20]。在血栓性微血管病患者中,50%的Stx相关HUS患者降解NETs的能力下降,且降解水平与血清肌酐含量呈负相关,表明NETs降解能力不足对肾功能产生了一定负面影响[12]。由此可知,NETs与HUS疾病的发生发展密切相关。

3.3 脓毒症AKI

脓毒症是由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍,是一种特殊类型的AKI,可引起肾血流动力学紊乱及肾灌注不足,导致炎症等恶性循环[21]。NETs的形成在脓毒症AKI中起关键作用,抑制脓毒症模型小鼠NETs形成可下调其肾组织炎症因子、降低肌酐及尿素氮水平,明显改善脓毒症导致的肾功能障碍[13]。AKI期间组织损伤释放的组蛋白会加重肾功能衰竭,而在体外,细胞外组蛋白与TLR2和TLR4相互作用,诱导MyD88、NF-κB和MAPK信号传导,对肾内皮细胞和肾小管上皮细胞有直接的毒性作用;将组蛋白直接注射到小鼠的肾动脉后,组蛋白也以TLR2/TLR4依赖性方式诱导白细胞募集、微血管渗漏、肾脏炎症,而抗组蛋白IgG可中和组蛋白的免疫刺激作用,抑制肾内炎症、中性粒细胞浸润和肾小管细胞坏死,并改善肾排泄功能障碍[22]。另有研究发现,通过小分子TAK-242或抗TLR4 IgG抑制TLR4可减少中性粒细胞NETs形成和ROS产生[23],为抑制NETs形成改善肾损伤提供了新的治疗策略。

3.4 COVID-19相关AKI

AKI已成为COVID-19常见的后遗症,CoV-2-AKI可能表现为塌陷性肾小球病、急性间质性肾炎或急性肾小管损伤[24]。体外研究表明SARS-CoV-2可激活人中性粒细胞NETosis并促进ROS生成[25]。活化的血小板表达P-选择素,导致血小板-中性粒细胞相互作用、中性粒细胞活化及NETs的释放,从而诱导COVID-19中的血栓炎症,进而导致终末器官损伤[26]。

4 NETs与慢性肾脏疾病

慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)以肾小球滤过率下降为主要特征,包括蛋白尿、高血压、水肿等多种临床症状,最终发展为终末期肾病[27]。NETs作为炎症发生过程中的重要组分,介导了多种类型CKD,如糖尿病肾病。

4.1 糖尿病肾病

DKD是糖尿病患者微血管发生的严重并发症之一,也是终末期肾脏病最常见的病因之一,临床上以肾小球基底膜增厚、细胞外基质形成增多、肾小管间质纤维化为主要特征,最终导致尿蛋白增加和估算肾小球滤过率(eGFR)降低[28],

研究表明,链脲佐菌素诱导的DKD小鼠模型及DKD患者肾脏组织中MPO及CitH3沉积明显增多,且肾小管区域E-cadherin表达明显下调、α-SMA表达明显上调;用高糖诱导的NETs干预人肾小管上皮细胞后,发现E-cadherin、α-SMA、Snail等上皮间质转化(EMT)相关蛋白向相反趋势变化,表明NETs可能通过介导肾小管EMT进程参与了糖尿病肾脏纤维化[29]。对糖尿病患者进行随访发现,NETs的主要成分双链脱氧核糖核酸(double strain deoxyribonucleic acid,dsDNA)浓度每增加1个标准差,发展为DKD的风险增加2.4倍;在T1DM与T2DM小鼠模型中,DNaseⅠ干预可显著抑制小鼠UACR水平的增高,减少肾脏糖原沉积,减轻足细胞及内皮细胞损伤;使用NETs干预肾小球血管内皮细胞后,内皮细胞的标志蛋白表达下调,同时白蛋白透过率增加,表明循环中dsDNA水平与DKD相关,且dsDNA可在一定程度上预测DKD进展[3]。

T1DM是胰腺β细胞发生特异性自身免疫性破坏,导致胰岛素绝对缺乏而引起营养物质代谢性异常疾病。在T1DM小鼠模型中,胰岛中中性粒细胞和NETs含量丰富,抑制中性粒细胞功能可减缓T1DM发展[30]。新生NOD小鼠的胰腺中中性粒细胞浸润并伴随着NE短暂升高,NE抑制剂可减弱NOD小鼠炎性巨噬细胞浸润,并通过抑制胰岛炎症显著降低T1DM发病率[31]。这些观察结果表明中性粒细胞和NETs在T1DM发病机制中起作用,调节NETs生成和中性粒细胞功能在治疗T1DM中具有重要意义。另有研究发现,T2DM患者蛋白尿异常时NETs水平较高,其主要成分MPO、NE与UACR、BUN水平呈正相关,NE与eGFR水平呈负相关,表明MPO和NE为UACR主要影响因素,可能通过促进肾脏炎症反应及纤维化等病理途径参与DKD的发生发展,有利于DKD早期诊断和病情监控,可作为未来诊断和评估DKD严重程度的潜在生物标记物[32]。除了在糖尿病发展中的潜在作用外,NETs生成增多还可导致糖尿病患者伤口迁延不愈。据报道,与正常小鼠相比,糖尿病小鼠的伤口中CitH3表达较高且愈合速度较慢,而DNaseⅠ治疗可加速伤口愈合[33]。二甲双胍是T2DM患者的一线降糖药物,治疗2个月后可降低患者血清中NETs相关成分MPO、CitH3的水平[34]。

4.2 双酚A所致慢性肾病

研究发现,长期低剂量双酚A(bisphenol-A,BPA)暴露会引起小鼠慢性肾脏损伤、肾功能下降,肾组织出现形态学变化,且该过程伴随NETs相关标志蛋白在肾小球的沉积。利用DNaseⅠ降解NETs可有效缓解BPA诱导的慢性肾脏损伤,肾功能有所恢复。通过体外实验表明DNase Ⅰ降解NETs后可有效缓解BPA诱导的足细胞损伤。以上证实了NETs参与BPA所导致的慢性肾损伤,对CKD的防治具有重要临床价值[35]。

5 NETs与自身免疫性肾病

含有DNA和抗dsDNA IgG抗体的免疫复合物沉积于肾脏并导致肾炎,组蛋白、dsDNA和中性粒细胞颗粒蛋白等多种NETs成分被认为是系统性自身免疫性疾病中自身抗原的重要来源[36]。当自身抗体效应机制未能及时消除NETs相关抗原时,就会发生炎症性组织损伤和细胞内抗原的释放,免疫介导损伤后组织修复机制的激活又可导致纤维化,并最终导致肾衰竭[37]。

5.1 狼疮性肾炎

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多器官自身免疫性疾病,LN为SLE累及肾脏导致的继发性免疫性肾小球疾病。SLE患者具有独特的中性粒细胞亚群,称为低密度粒细胞(low-density granulocytes,LDGs),可刺激浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)产生Ⅰ型IFN-α[38]。研究表明,SLE患者外周血单核细胞中的LDGs可自发形成NETs[39]。如果NETs不能被DNaseⅠ完全降解,则会与其他蛋白质形成复合物长时间存在,导致抗原刺激延长并沉积在肾小球基底膜上,从而诱发肾炎[40]。另有研究发现,中性粒细胞过度释放NETs和DNaseⅠ不完全清除是LN患者血浆中cfDNA水平升高的主要原因,导致蛋白尿、白蛋白水平下降和肌酐清除率降低[41]。DNaseⅠ缺陷可导致自身抗体产生,增加小鼠患SLE的风险,发生更严重的肾损伤[42]。NETs通过B细胞受体和TLR9激活B细胞,产生抗DNA和LL-37的自身抗体,而自身抗体与NETs中DNA和LL-37结合的抗DNA复合物可被pDC和B细胞识别,从而使自身免疫性炎症持续存在,形成有害的自身免疫循环[43]。

NETs的凋亡或坏死物质是自身抗原的主要来源,负责促进自身免疫和加剧组织损伤,自身抗体通过阻止其降解和促进激活补体使NETs持续存在[44],因此NETs成分和针对它们的自身抗体与SLE密切相关。有研究发现MRL/lpr狼疮小鼠中NETs形成较快,且可产生针对NETs的自身抗体,并常伴有内皮功能障碍,PAD抑制剂可显著改善内皮功能,同时下调IFN下游基因的表达,还可减少蛋白尿和免疫复合物沉积[45]。虎杖甙处理也可在体内外显著抑制ROS介导的NETs形成,降低MRL/lpr小鼠蛋白尿、自身循环抗体水平和免疫复合物在肾脏中的沉积[46]。

活动性SLE中性粒细胞释放的NETs富含组织因子和IL-17A,在肾脏等多个靶器官中促进血栓形成、炎症、组织损伤和纤维化。在狼疮肾炎患者中,可观察到由肾小球内的组织因子和靠近肾小球囊的小管间质室形成的NETs,表明NETs可能参与包膜破裂和新月体形成[47]。研究表明,LN样本中mtDNA和MPO共定位于中性粒细胞浸润区域,且抗mtDNA自身抗体、蛋白尿量与LN活动指数有较强相关性;二甲双胍预处理可呈浓度依赖性抑制NETs的形成,并减少由mtDNA刺激的浆细胞样树突状细胞中IFN-α的分泌,与单独使用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)治疗的中性粒细胞相比,二甲双胍在PMA刺激40 min后使NETs中的mtDNA拷贝数减少了57%[48]。以上结果表明NETs参与了LN的发病机制,可作为LN或其他自身免疫性疾病的治疗靶点,为治疗LN提供了新的切入点。

5.2 抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies associated vasculitis,AAV)是一种以血管炎症、内皮损伤和组织损伤为特征的自身免疫性疾病,主要累及肾脏、肺、皮肤和周围神经,研究表明中性粒细胞与ANCA-IgG共同孵育可诱导NETs生成,且AAV血清中DNA-MPO复合物水平较高[49]。MPO和组蛋白对人上皮细胞和内皮细胞具有直接的细胞毒性作用,细胞外MPO可诱导AAV患者肾小球和间质损伤[50]。此外,对AAV患者的肾活检标本进行免疫染色显示,在炎症区域、伴有坏死性肾小球肾炎的肾脏纤维蛋白样坏死区域周围以及小叶间动脉壁存在CitH3、MPO和PAD4,表明NETs的形成与AAV中的血管损伤和免疫系统激活有关[51]。

6 NETs与其他肾脏疾病

6.1 肾癌

肾细胞癌是泌尿系统常见的肿瘤之一,约占成人恶性肿瘤的3%。NETs释放的DNA成分可成为癌细胞的趋化因子,而不仅仅是癌细胞的“诱捕网”。NETs作为中性粒细胞发挥免疫作用的重要途径之一,可在肾癌患者的外周血中检出,循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)计数与NETs产生的关键分子如MPO、ELANE、MMP-9、PAD4、CTSG、HMGB2等的表达呈正相关,NETs形成的DNA骨架与纤维蛋白网能够捕获肾癌CTC,以协助其逃过免疫系统的攻击并存活[52]。研究表明,荷瘤小鼠表现出肾损伤的临床特征,通过使用DNaseⅠ或PAD4抑制剂对胰岛素瘤RIP1-Tag2小鼠或乳腺癌MMTV-PyMT小鼠进行全身治疗,可去除NETs,缓解肾损伤,使心脏和肾脏血管灌注恢复到健康小鼠的水平[53]。以上结果表明NETs与肾癌发生发展存在相关性。

6.2 肾移植排斥

急性抗体介导的排斥反应(acute antibody-mediated rejection,AAMR)是器官移植失败的主要原因之一[54],其关键临床特征是微血管炎症,具体表现为内皮损伤及毛细血管内存在以激活中性粒细胞为主的免疫细胞[55-56]。研究表明,肾移植患者血浆中NETs数量较多,且AAMR的组织样本中网状中性粒细胞丰富;与供体相比,所有肾移植患者的自发性NETosis均增强[57],表明NETs可能为肾移植排斥反应的发病机制之一。

7 小结

本文总结了NETs在急性肾损伤、慢性肾病、狼疮性肾炎等多种肾病发生发展中的作用。近年来国内外的研究表明,NETs除了能杀灭病原微生物外,还从多方面参与并影响了肾脏疾病的病理生理过程,其关键成分MPO、CitH3、NE对疾病的发生发展都起着关键作用。虽然NETs在这些肾脏疾病中的具体作用机制及治疗干预手段的研究尚处于起步阶段,但已有的研究结果表明,DNaseⅠ或PAD4抑制剂可有效缓解多种肾脏疾病所致组织损伤;MPO抑制剂,如4-氨基苯甲酸酰肼或PF-1355,可减少NETs生成、中性粒细胞募集和循环细胞因子水平[58-59]。使用此类抑制剂可能会改善免疫复合物介导疾病患者的预后,例如SLE、血管炎和各种类型的肾小球肾炎。进一步明确NETs在肾脏疾病中的作用及其相关分子机制,如中性粒细胞和NETs与其他细胞类型(如血小板和内皮细胞)之间的关联,将会为今后肾脏疾病的治疗和特异性靶点药物的开发提供新的发展思路。但由于NETs结构的特殊性,目前其浓度检测尚未用于临床,NETs的体内定量研究尚处于初级阶段。今后,需进一步完善、精确化NETs检测,实现肾病临床预后的早期识别。本课题组也在深入研究NETs在肾纤维化进程中的作用,以期为肾纤维化治疗提供新的靶点。