李 旭, 黄思剑, 李健伦, 牟 漫, 张荣辉, 钟茂华△

1武汉科技大学医学院感染免疫与肿瘤微环境研究所,武汉 430065 2武汉科技大学附属武昌医院病理科,武汉 430063

自2020年年初起,由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎在全球大流行,对人类健康和社会生活构成全球性威胁。新型冠状病毒肺炎的全球大流行再次警醒我们:人类依然面临着传染病的巨大威胁。传染病是由细菌、病毒、真菌等多种病原体入侵人体后造成的局部或全身性损伤。疫苗接种是预防传染病最有效的措施。包括HIV、流感、麻疹、新型冠状病毒在内的大多数病原主要通过黏膜途径入侵机体。黏膜表面的分泌型IgA具有抑制病原在黏膜表面的运动、生长、粘附的作用以及独特的胞内中和等功能[1];黏膜部位的T细胞具有直接杀伤病原感染细胞、分泌细胞因子抑制病原增殖的功能。因而,通过疫苗接种预先诱导有效的黏膜免疫应答是预防传染病的有效手段。研究表明经鼻腔免疫可以诱导有效的黏膜免疫应答。然而,大多数疫苗尤其是亚单位疫苗经鼻腔接种后难以诱导有效的黏膜免疫应答,需要借助佐剂的辅助作用。黏膜佐剂作为一种免疫增强剂,不仅可以增强抗原的免疫原性,提高机体的免疫应答水平,还可通过降低抗原用量、减少接种次数从而提高疫苗的安全性、降低疫苗的成本。

鞭毛蛋白(flagellin)是细菌鞭毛丝状体的主要结构蛋白,是一种独特的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),能够激活Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)及NLRC4两条信号通路,诱导炎性因子及趋化因子的释放,进而募集和活化树突状细胞(dendritic cell,DC),激活宿主的天然免疫进而启动获得性免疫应答。基于上述免疫学特性,鞭毛蛋白的佐剂活性得到了广泛而深入的研究。本文就鞭毛蛋白的分子结构、诱导的信号通路、作为疫苗佐剂的应用及机制作一综述。

1 鞭毛蛋白的分子结构

大多数革兰阴性菌均具有鞭毛。鞭毛是细菌的运动器官,由基体、钩状体和丝状体组成。丝状体是由鞭毛蛋白呈螺旋状缠绕而成的中空管状结构。鞭毛蛋白折叠成发夹结构,其N末端(约170个氨基酸)和C末端(约100个氨基酸)高度保守,组成α螺旋结构域,即D0、D1结构域;中央区在氨基酸组成和大小方面差别很大,为高变区,构成带有β折叠的D2、D3结构域(图1)。保守区负责鞭毛的组装、细菌运动以及免疫信号转导。高变区为鞭毛蛋白的抗原优势表位区,参与蛋白质折叠、宿主细胞粘附、入侵及逃避宿主免疫反应,与鞭毛稳定性及细菌毒力相关。

A:细菌表面鞭毛;B:鞭毛蛋白单体结构,D0、D1为保守区,D2、D3为高变区图1 鞭毛及鞭毛蛋白的结构示意图Fig.1 Schematic gram for flagella and flagellin

2 鞭毛蛋白的信号通路

鞭毛蛋白能够激活TLR5及NLRC4两条信号通路。TLR5是模式识别受体Toll样受体家族中的一员,为单次跨膜蛋白,主要识别细胞外鞭毛蛋白并激活下游信号。它由胞外区的富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat,LRR)以及胞质内的TIR结构域(Toll/interleukin-1 receptor)组成,主要表达于DC、巨噬细胞、上皮细胞等。TLR5通路的激活与保守结构域尤其是D1结构域密切相关,其关键识别位点为89～96位氨基酸残基(QRIRELAV)[2-3]。这段氨基酸的缺失或突变将导致TLR5活性的丧失。

TLR5通过LRR识别单体鞭毛蛋白后形成同源二聚体,其胞内的TIR结构域被激活并募集衔接分子MyD88,并通过MyD88 N末端的死亡结构域招募带有相同结构域的IRAK4,相继激活IRAK1和TRAF6。在泛素连接酶TRAF6的作用下使蛋白激酶TAK1与结合蛋白TAB1和TAB2形成一个复合体,两条下游信号通路被激活。其中一条为MAPK途径,当MAPK被激活后,癌基因产物Jun和Fos转移至细胞核内,使转录因子AP-1被激活,促发炎症反应。另一条途径由TAK1复合体启动IKK激酶复合体,后者进而促进IκB分子磷酸化及泛素化降解,使转录因子NF-κB被激活并转移至核内。在上述2条信号通路的共同作用下,IL-6、TNF-α等炎性细胞因子及DC表面共刺激分子CD80、CD86表达被上调(图2左)[4-5]。

NLRC4/IPAF炎症小体是NLR家族中的一员,是鞭毛素蛋白的另外一条信号通路。当革兰阴性菌通过三型分泌系统(T3SS)将鞭毛蛋白注入宿主细胞胞质内,可被NLRC4所识别。在通过募集带有相同CARD结构域的衔接分子ASC后,与半胱氨酸天冬氨酸水解酶(Caspase-1)相互作用,导致Caspase-1被激活,被激活的Caspase-1通过蛋白水解作用促进IL-18和IL-1β的前体被裂解为成熟的IL-18和IL-1β(图2右)[6-7]。

3 鞭毛蛋白作为佐剂在疫苗中的研究进展

3.1 鞭毛蛋白在鼠疫疫苗中的研究进展

鼠疫是由革兰阴性菌鼠疫耶尔森菌引起的烈性传染病,通过蚤类叮咬、飞沫、胃肠道等途径传播,以发展速度快、死亡率高为特征。人鼠疫包括:腺鼠疫、肺鼠疫和败血症型鼠疫三大临床类型。其中,肺鼠疫的危害最大且传染性极强,主要通过接触患者或吸入飞沫感染。目前在用的鼠疫疫苗是用鼠疫弱毒菌株生产的活疫苗,采用皮上划痕接种。由于现用的鼠疫疫苗的有效性和安全性均存在不足,研究者们正在研发更加安全、高效的疫苗,其中安全性良好的亚单位疫苗最受青睐。免疫原性强、可诱导保护性抗体应答的荚膜抗原F1以及抗原V通常作为鼠疫亚单位疫苗的靶标。美国维克森林大学的Steven B.Mizel团队多年来一直致力于以鞭毛蛋白为佐剂、F1/V为免疫原的鼠疫黏膜疫苗的研发。该团队首先在2006年报道了鞭毛蛋白的黏膜佐剂活性:鞭毛蛋白与抗原F1混合滴鼻免疫,可在小鼠体内诱导高滴度、长时效的F1特异性血清IgG应答并产生80%以上的攻毒保护率;鞭毛蛋白与融合蛋白F1/V混合滴鼻免疫,可在猕猴体内诱导高滴度的F1/V特异性血清IgG应答[8]。该团队于2009年报道了将鞭毛蛋白与F1/V进行基因工程融合,构建了融合蛋白flagellin/F1/V;经2轮滴鼻免疫后,该蛋白在小鼠体内诱导的F1及V特异性的IgG滴度达106以上,并产生100%的攻毒保护[9]。后续Ⅰ期临床研究结果显示,flagellin/F1/V的安全性良好,在受试者体内能够诱导有效的抗体应答[10]及T细胞应答[11]。

TLR5识别细胞外鞭毛蛋白,通过TIR结构域同型募集衔接分子MyD88启动下游信号(左);入侵细胞内的鞭毛蛋白被胞质内的NLRC4所识别,通过形成炎症小体,促进促炎相关细胞因子分泌(右)图2 鞭毛蛋白的TLR5及NLRC4两条信号通路Fig.2 TLR5 and NLRC4 signaling pathways of flagellin

3.2 鞭毛蛋白在口腔疾病——龋齿疫苗中的研究进展

龋齿是一种由细菌感染引起的慢性进展性口腔疾病,发病人群范围广,对人类健康及公共卫生危害巨大。随着对龋患认识的逐步提高,抗龋疫苗的研发得到越来越多的关注,有望成为未来控制龋患的主要手段。多国科学家经过数十年的深入研究,认为变异链球菌(Streptococcusmutans)是主要的致龋病原菌,而其代谢产生的乳酸使牙釉质脱钙进而侵害牙本质和牙髓为其致龋机制[12]。免疫学研究则证明机体主要的防龋效应因子是口腔唾液中的特异性IgA抗体,主要疫苗抗原靶标包括变异链球菌纤维样表面粘附素(PAc)、糖基转移酶(GTF)以及葡聚糖结合蛋白(GBP)[13-15]。诱导这些抗原靶标特异的口腔黏膜IgA应答是研发有效抗龋疫苗的关键。

鄢慧民研究员领导的黏膜免疫学科组,长期致力于黏膜IgA功能、黏膜佐剂以及黏膜疫苗的研究和应用,开展了一系列以重组鞭毛蛋白为黏膜佐剂的龋齿疫苗的研究工作。该团队首先报道了鞭毛蛋白作为鼻黏膜佐剂能有效增强DNA疫苗pGJA-P/VAX的免疫原性,诱导大鼠产生PAc特异性的高滴度血清及唾液IgA应答,显著降低龋坏程度[16]。随后,该研究团队将重组鞭毛蛋白佐剂与免疫原重组PAc(rPAc)进行基因工程融合,获得了高效诱导rPAc特异性的口腔黏膜IgA应答,具有高效防龋、抑龋效果的第一代抗龋疫苗——KF-rPAc[17-18]。在此基础上,该团队进一步优化了免疫原设计,去除了与鞭毛蛋白佐剂活性无关的部分,筛选获得了第二代融合蛋白抗龋疫苗——KFD2-rPAc。与第一代融合蛋白疫苗相比,KFD2-rPAc保持了第一代融合蛋白疫苗高效诱导特异性免疫应答的能力和防龋、抑龋的性能,而且大大减少了鞭毛蛋白本身的免疫原性和TLR5相关的全身性炎症反应[19]。牙菌斑作为生物膜,是牙齿表面的微生物群落,并嵌合宿主和细菌来源的各种基质,龋齿中产酸和耐酸物种(主要为变异链球菌)逐渐成为优势群落。因此,通过抑制生物膜发育、防止龋齿细菌附着是控制龋齿的重要手段[20-21]。利用体外研究,该团队证实KF-rPAc免疫动物的血清不能抑制变异链球菌的增殖,但可抑制其生物膜的形成,提示KF-rPAc诱导的抗体应答主要通过抑制生物膜的形成干预龋齿的发生和进展[18]。

除鄢慧民研究团队外,巴西的Batista等[22]也开展了以鞭毛蛋白为佐剂、PAc蛋白作为免疫原的龋齿疫苗研发工作。该团队将鞭毛蛋白与PAc混合后,皮下免疫3次,可诱导小鼠产生高滴度的PAc特异性血清IgG应答。体外实验显示小鼠免疫血清可抑制变形链菌与唾液凝集素的粘附。然而,作者并未在动物体内探究该疫苗的抗龋效应。

3.3 鞭毛蛋白在呼吸道疾病中的研究进展

3.3.1 鞭毛蛋白在呼吸道合胞病毒疫苗中的研究进展 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下人群呼吸道感染的重要病毒之一,也是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。RSV感染婴幼儿常引起下呼吸道疾病,如毛细管支气管炎或肺炎并伴有呼吸窘迫等症状。全球每年因感染RSV死亡的婴幼儿高达9.46万～14.94万人[23]。然而,迄今为止,尚无RSV疫苗被批准上市。

RSV是有包膜的、非分节段的单负链RNA病毒。RSV共编码11个蛋白:3种膜表面糖蛋白(F蛋白、G蛋白和SH蛋白);2个非结构蛋白(NS1和NS2)及6个内在结构蛋白(L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白、M2-1和M2-2蛋白)。F蛋白和G蛋白是唯一能够诱导产生中和抗体的病毒蛋白,也是主要的保护性抗原,常用作疫苗的靶标抗原[24]。美国Singh团队将RSV的表面蛋白F、G及结构蛋白M2进行基因工程融合,用原核表达系统制备了重组融合蛋白rRFM2G,并将其单独或与鞭毛蛋白混合后滴鼻免疫小鼠。研究结果表明rRFM2G可诱导一定强度的抗体应答,但鞭毛蛋白并未起到有效的增强抗体应答的作用[25]。

鄢慧民研究员领导的黏膜免疫团队以RSV的结构蛋白P蛋白作为疫苗靶标,将其与大肠埃希菌K12菌株来源的鞭毛蛋白(KFD1)进行重组融合,获得融合蛋白P-KFD1。采用滴鼻免疫和RSV攻毒的小鼠模型,研究人员发现P-KFD1不仅能够有效地降低上呼吸道及下呼吸道的病毒载量,还不会引起疫苗增强的疾病作用。作者随后深入分析了P-KFD1介导免疫保护的机制。病毒内在蛋白特异性IgA通过多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR))介导IgA转运,可在体外及体内发挥胞内中和、抑制病毒复制的效应。然而,P-KFD1在pIgR基因敲除小鼠和野生型小鼠体内的保护效应无显著差异。此外,小鼠免疫血清过继转移实验也未显现出免疫保护作用。因此,研究人员排除了抗体介导的免疫保护作用。然而,清除CD4+T细胞后,P-KFD1介导的免疫保护作用基本消失殆尽。上述研究结果表明P-KFD1的免疫保护作用主要由CD4+T细胞介导。这种特异性的CD4+T细胞通过分泌IFN-γ和IL-17A,在外周及呼吸道局部发挥抗病毒效应。鉴于其良好的安全性和有效性,P-KFD1作为一种RSV黏膜疫苗,具有潜在的临床应用价值[26]。

3.3.2 鞭毛蛋白在新型冠状病毒疫苗中的研究进展 新冠病毒是一种有包膜结构的单股正链RNA病毒,刺突(spike,S)蛋白是其重要的结构蛋白,通过蛋白受体结合域(receptor binding domian,RBD)与宿主细胞上血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,介导病毒的吸附和入侵。基于此,S蛋白尤其是其RBD结构域成为疫苗设计的关键靶点。

国内外多个研究小组开展了以鞭毛蛋白作为新冠病毒疫苗的佐剂研究。Mardanova等[27]利用烟叶生产鞭毛蛋白和RBD的融合蛋白,产量高达100 μg/g新鲜烟叶组织,但研究仅停留在蛋白表达和纯化层面,并未进行深入的免疫及攻毒保护研究。M、N以及ORF3a蛋白在人冠状病毒的不同株系间高度保守而且具有较强的免疫源性,将这3个抗原纳入疫苗靶标,有可能介导冠状病毒不同株系间的交叉保护。研究人员基于M、N以及ORF3a的序列,设计了一个多表位蛋白NOM,将NOM与鞭毛蛋白融合后,获得FNOM,利用大肠埃希菌系统进行表达并采用皮下注射的方式免疫动物。与单独免疫S蛋白的小鼠相比,FNOM+S联合免疫组既显著增强抗体应答又提高了细胞免疫应答[28]。胡涛研究员及其团队利用原核表达系统制备RBD,然后利用化学偶联的方式,将鞭毛蛋白(IC28)或TLR4配体甘露糖(mannan)与其进行共价连接,分别获得RBD-IC28、RBD-M及RBD-IC28-M。经肌肉注射免疫小鼠后,偶联双佐剂的RBD-IC28-M诱导的血清RBD特异性的结合抗体应答、中和抗体应答以及T细胞应答均显著高于单独的RBD或者仅偶联一种佐剂的RBD[29]。

新型冠状病毒首先入侵上呼吸道,病毒在鼻咽黏膜处进行复制并通过空气进行传播,因此需要在鼻咽黏膜表面预先建立一个有效的保护系统,来预防病毒的感染和传播。传统的肌注疫苗仅能诱导系统免疫应答,很难在鼻黏膜处发挥抗感染效应。《Cell Reports》和《Cellular &Molecular Immunology》最近相继报道了我国科学家研发的2款滴鼻式新冠病毒亚单位黏膜疫苗。孙明波研究员团队将N蛋白及具有融合前构象的S蛋白作为疫苗靶标、鞭毛蛋白KF和cGAMP作为双佐剂组合成一个候选疫苗。滴鼻免疫小鼠后,该疫苗增强了血清和黏膜部位的抗体应答,攻毒保护率达100%。与灭活苗相比,这种双佐剂的黏膜疫苗能对上呼吸道产生更好的免疫保护[30]。鄢慧民研究员团队用鞭毛蛋白KFD作为骨架,嵌合了1个新冠病毒delta RBD和2个Omicron RBD,构成了一个亚单位疫苗3Ro-NC。将3Ro-NC与重组鞭毛蛋白佐剂KFD混合滴鼻免疫小鼠后,不仅可诱导高滴度RBD特异性血清IgG及广谱的中和抗体应答,还可诱导唾液、生殖道灌洗液、鼻洗液等黏膜样本中的IgA应答。hACE2转基因小鼠的攻毒实验发现,3Ro-NC+KFD滴鼻免疫与肌注的灭活疫苗可诱导相当水平的血清中和滴度;但3Ro-NC在诱导黏膜IgA、抑制上呼吸道及鼻甲骨中病毒拷贝数、减轻肺部损伤等方面,显示出良好的优势[31]。上述2款鼻腔吸入式新冠疫苗均显示黏膜疫苗除了能像传统灭活疫苗一样诱导高滴度的血清中和抗体应答及肺部保护外,还表现出可诱导黏膜IgA应答、对上呼吸道起到良好免疫保护的优势。

3.4 鞭毛蛋白在HPV和HIV疫苗中的研究进展

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficency virus,HIV)是艾滋病的病原体,人类乳头瘤病毒(human pappiloma virus,HPV)是宫颈癌的主要病原体,二者均主要通过性行为进行传播。目前,已有多款VLP(virus like particle)形式的HPV疫苗上市,但尚无安全有效的HIV疫苗上市。研究显示鞭毛蛋白与HIV或HPV抗原复合后,均展现出良好的佐剂活性,疫苗形式包括重组蛋白/多肽疫苗、VLP及纳米颗粒等。Vassilieva等[32]制备的一个共表达HIV的包膜抗原Env及鞭毛蛋白的VLP,肌注和滴鼻免疫均可诱导高滴度的Env特异性的血清IgG及中和抗体应答,但仅有滴鼻免疫可诱导生殖道灌洗液中的IgG和IgA应答。鞭毛蛋白与HPV抗原直接混合或制备成融合蛋白,可诱导高效的抗体及T细胞及应答,保护实验动物免受病毒攻毒引起的感染[33-35],还可达到预防肿瘤发生[36]及治疗肿瘤的目的[37]。但以鞭毛蛋白为佐剂的HIV及HPV疫苗研究目前均仅停留在实验室阶段,尚未进入临床研究。

4 鞭毛蛋白作为佐剂的机制研究进展

如前文所述,鞭毛蛋白具有TLR5与NLRC4两条信号通路,具体依赖哪条信号通路与免疫途径密切相关。如果免疫途径为腹腔注射,任一通路均足以让鞭毛蛋白发挥有效的佐剂活性[38];但滴鼻免疫仅依赖于TLR5通路[39-40]。与信号通路类似,鞭毛蛋白对DC的激活机制也与免疫途径密切相关。腹腔注射的鞭毛蛋白可直接激活DC,但滴鼻免疫的鞭毛蛋白不能直接激活DC,而是首先通过TLR5通路激活呼吸道上皮细胞,使其分泌GM-CSF等细胞因子,进而对DC发挥间接激活的作用[40-41]。呼吸道DC低表达TLR5而上皮细胞高表达TLR5[39]可能是滴鼻免疫途径鞭毛蛋白独特激活DC的原因。

5 总结和展望

鞭毛蛋白作为鼻腔黏膜佐剂的效应已被广泛证实:在诱导系统免疫应答的同时,还能增强黏膜应答,尤其是分泌型IgA的产生。除优良的佐剂活性外,鞭毛蛋白还具有毒性低、制备简单、改造空间大等优势,已成为一个极具临床应用前景的新型候选黏膜佐剂[42-43]。鉴于目前大多数病原主要通过黏膜途径入侵机体,利用鞭毛蛋白作为黏膜佐剂开发安全有效的黏膜疫苗,预先在黏膜系统建立免疫屏障,将是疫苗的理想形式。前文中提到的多款以鞭毛蛋白为鼻腔黏膜佐剂的疫苗,如龋齿疫苗、RSV疫苗、新冠病毒疫苗都展现出了高效的黏膜免疫诱导能力及免疫保护作用,都极具临床应用前景。