杨 铭, 李 梅, 孙 畅, 郑士耀, 梁伟华,苗婷婷, 胡浇浇, 胡建明, 曹玉文, 李 锋,2, 杨 兰△

1石河子大学医学院病理系/石河子大学第一附属医院病理科,石河子 832000 2首都医科大学附属北京朝阳医院病理科,北京 100020

食管癌(esophageal carcinoma,ESCA)是消化系统常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,其发病率位于所有恶性肿瘤的第7位,死亡率居第6位[1]。我国是食管癌高发国家,食管癌按其组织学分类主要分为食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC),其中食管鳞癌在我国最为常见,约占90%[2]。食管癌的发病率具有明显的地域性和种族差异性,新疆是其高发地区之一,其中以哈萨克族(哈族)食管鳞癌发病率最高,达155.9/10万,远超过全国平均发病率水平(14.95/10万),而新疆汉族食管鳞癌发病率仅为13/10万[3]。

目前食管鳞癌的病因及发病机制尚未完全阐明,越来越多的证据表明,转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路在上消化道肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用[4]。据报道,TGF-β信号通路在包括ESCC在内的多种癌症类型中具有双重功能,根据肿瘤分期和背景,可作为肿瘤启动子或肿瘤抑制子[5-7]。而多数研究证实TGF-β信号通路在ESCC中起促癌作用[8-10]。

在TGF-β信号通路激活过程中,转化生长因子β-1型受体(transforming growth factor-β receptor 1,TGFBR1,TβR1)被招募到TGF-β/TβR2复合体中,通过磷酸化Smad2和Smad3启动信号传导,磷酸化的Smad2/Smad3与Smad4结合形成异质复合体,易位到细胞核,调节靶基因的转录应答。此过程中,TβR1主要负责信号传导,而Smad蛋白则是TGF-β通路最核心的组分,Smad2/3的磷酸化(phosphorylation of Smad2/3,p-Smad2/3)状态直接反映了TGF-β通路的活性。Dong等[11]认为,TβR1在食管鳞癌发生发展过程中发挥着重要作用,在肿瘤中TβR1和脯氨酸导向激酶对Smad2和Smad3进行不同程度的磷酸化,从而产生它们的磷酸化异构体[12-15],而Horitani等[16]发现p-Smad2/3阳性细胞出现在侵袭性食管鳞癌黏膜下浸润和血管浸润部位,p-Smad2/3可能影响食管鳞癌的浸润和转移。因此,探讨TβR1及p-Smad2/3在食管鳞癌中的表达状况可进一步反映TGF-β/Smad通路在食管癌中的活化状态及在食管癌中所起的作用。故本研究采用免疫组织化学(免疫组化)技术联合检测了TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鳞癌组织中的表达情况,首次分析了TβR1和p-Smad2/3在食管鳞癌组织中的表达及其相关性,初步探讨了TβR1和p-Smad2/3蛋白表达水平与食管鳞癌浸润深度、淋巴结转移及患者生存的关系。为阐明TGF-β/Smad信号通路关键分子与食管鳞癌侵袭转移和预后的关系提供理论依据,并为进一步寻找食管鳞癌的发生发展及预后的分子靶标提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

兔抗TβR1和p-Smad2/3多克隆抗体均购于Santa Cruz公司;Envision二步法试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒均购于美国Dako公司;石蜡包埋机购于中国德立森公司;组织切片机购于德国莱卡公司;60℃烤箱购于中国上海一恒科学仪器厂;普通光学显微镜和病理图像采集系统购于日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析 从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载食管癌基因芯片数据集GSE161533和GSE20347,筛选食管癌中差异表达的mRNA;KOBAS网站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)分析差异表达的mRNA主要富集的通路;运用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)进行TGF-β信号通路蛋白相互作用预测,Cytoscape v3.9.0分析软件筛选出其中的核心基因;通过GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TβR1蛋白在泛癌中的表达情况;TIMER网站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析TβR1和Smad2及Smad3蛋白表达的相关性。

1.2.2 食管鳞癌及配对正常组织样本的获取 收集2009年到2015年间伊犁友谊医院和新华医院的127例哈族食管鳞癌组织样本及其中对应的82例哈族食管正常组织标本。所有样本均先经过10%中性福尔马林固定、石蜡包埋处理后切片,随后苏木精-伊红(HE)染色,再由2位高年资临床病理学医师阅片进行确认。

1.2.3 组织芯片的制备及免疫组化染色 利用上述食管鳞癌样本及配对正常组织样本制备组织芯片,将包埋好的组织芯片蜡块连续切片,石蜡切片经二甲苯脱蜡后,梯度乙醇进行脱水,切片加枸橼酸缓冲液进行微波抗原修复;切片加兔抗人多克隆TβR1抗体(sc-398,Santa Cruz公司,稀释度1∶500)或兔抗人多克隆p-Smad2/3抗体(sc-11769,Santa Cruz公司,稀释度1∶50),4℃孵育过夜;加二抗孵育后用DAB显色,苏木精复染。免疫组化实验结果判定根据阳性细胞比例及染色程度评分。阳性细胞比例评分:<5%为0分,5%～为1分,26%～为2分,51%～为3分,>75%为4分;染色程度评分:无着色为0分,浅棕黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。结果判定由2位病理学专家阅片,取上述两项分值的乘积作为总积分:0～1分为阴性(-),2～4分为弱阳性(1+),5～8分为中度阳性(2+),9～12分为强阳性(3+);其中得分处于0～4分之间为低表达,得分处于5～12分之间为高表达。

1.3 统计学方法

本研究数据均使用统计学软件SPSS 26.0进行分析。采用χ2检验分析TβR1和p-Smad2/3在哈族食管鳞癌及癌旁正常组织中的蛋白表达水平及其与食管癌患者临床病理参数的关系;使用Spearman秩相关分析TβR1与p-Smad2/3蛋白在哈族食管鳞癌中表达的相关性;Kaplan-Meier分析比较TβR1和p-Smad2/3蛋白低表达和高表达患者之间总体生存的差异;以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF-β信号通路及其关键因子与食管癌相关性的生物信息学分析

利用基因芯片数据集GSE161533和GSE20347筛选出差异表达mRNA,通过在线分析网站KOBAS进行KEGG通路富集分析,发现TGF-β信号通路与食管癌相关(图1A);随后应用STRING数据库进行TGF-β信号通路的94个基因的蛋白相互作用预测,再通过Cytoscape分析软件筛选出TGF-β信号通路的核心基因(图1B),结果发现TβR1和Smad2/3为TGF-β信号通路核心基因,提示TβR1和Smad2/3在TGF-β信号通路中发挥着重要作用。GEPIA在线网站分析TβR1在泛癌中的表达情况,发现TβR1在食管癌中表达上调,且食管癌为所有肿瘤中TβR1表达较高的肿瘤之一(图1C)。为了进一步研究TβR1和Smad2/3在食管癌中的关系,我们通过在线分析网站TIMER分析其相关性(图1D),结果显示TβR1和Smad2/3在食管癌中的表达呈正相关。上述结果提示TGF-β信号通路中的TβR1和Smad2/3与食管癌高度相关。

A:基因芯片数据集GSE161533(左)和GSE20347(右)差异表达基因的KEGG通路富集分析;B:TGF-β信号通路核心基因筛选;C:TβR1在多种肿瘤中的表达情况;D:TβR1和Smad2(左)以及TβR1和Smad3(右)在食管癌中表达相关性散点图图1 TGF-β信号通路及其关键因子在食管癌中的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of TGF-β signaling pathway and its key factors in esophageal carcinoma

2.2 TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鳞癌中表达上调且呈正相关

我们运用免疫组化技术检测了103例(127例中24例脱片或无法判读)哈族食管鳞癌组织和73例(82例中9例脱片或无法判读)癌旁正常组织中TβR1蛋白表达情况,及107例(127例中20例脱片或无法判读)哈族食管鳞癌组织和80例(82例中2例脱片)癌旁正常组织中p-Smad2/3的蛋白表达状况。结果显示,TβR1蛋白表达主要定位于细胞质中(图2A～2D),而p-Smad2/3的蛋白表达主要定位于细胞核中(图2E～2H),且TβR1蛋白和p-Smad2/3蛋白在哈族食管鳞癌中的表达均明显高于癌旁正常组织(χ2=25.345,P=4.79×10-7;χ2=35.775,P=2.21×10-9)(表1)。此外,对食管鳞癌组织中TβR1蛋白与p-Smad2/3蛋白表达的相关性分析显示二者呈正相关(r=0.322,P=0.002)。以上结果表明TβR1和Smad2/3在食管鳞癌中表达均上调且呈正相关。

A:癌旁正常组织中TβR1阴性表达(-);B:食管鳞癌组织中TβR1弱阳性表达(1+);C:食管鳞癌组织中TβR1中度阳性表达(2+);D:食管鳞癌组织中TβR1强阳性表达(3+);E:癌旁正常组织中p-Smad2/3阴性表达(-);F:食管鳞癌组织中p-Smad2/3弱阳性表达(1+);G:食管鳞癌组织中p-Smad2/3中度阳性表达(2+);H:食管鳞癌组织中p-Smad2/3强阳性表达(3+)图2 哈族食管鳞癌组织及癌旁正常组织中TβR1蛋白和p-Smad2/3蛋白免疫组化染色结果(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining results of TβR1 and p-Smad2/3 protein in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissues(×200)

表1 TβR1和p-Smad2/3蛋白在食管鳞癌及癌旁正常组织中的表达情况(例)Table 1 Expression of TβR1 and p-Smad2/3 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissues (n)

2.3 TβR1和p-Smad2/3蛋白表达水平与哈族食管鳞癌的浸润深度及淋巴结转移密切相关

利用免疫组化结果对TβR1、p-Smad2/3蛋白表达水平与哈族食管鳞癌患者临床病理参数进行统计学分析,TβR1、p-Smad2/3蛋白表达与食管鳞癌的浸润深度密切相关(χ2=11.943,P=0.003;χ2=10.651,P=0.005),且在有淋巴结转移的样本中的表达明显高于无淋巴结转移的样本(χ2=4.811,P=0.028;χ2=21.614,P=3×10-6),而TβR1、p-Smad2/3蛋白表达情况与患者年龄、性别和肿瘤分化程度无明显相关性(均P>0.05)(表2)。以上结果提示TβR1、p-Smad2/3蛋白的高表达与食管鳞癌的浸润深度和淋巴结转移密切相关。

表2 食管鳞癌组织中TβR1和p-Smad2/3蛋白表达水平与患者临床病理参数之间的关系(例)Table 2 Relationship between expression levels of TβR1 and p-Smad2/3 protein and clinicopathological parameters in patients with esophageal squamous cell carcinoma (n)

续表2

2.4 TβR1和p-Smad2/3蛋白表达水平影响哈族食管鳞癌患者预后

Kaplan-Meier生存分析显示,TβR1、p-Smad2/3蛋白低表达组患者的术后中位生存时间分别为33.5个月和32.0个月,而TβR1、p-Smad2/3蛋白高表达组患者的术后中位生存时间分别为18.0个月和18.5个月。TβR1、p-Smad2/3蛋白高表达组患者术后生存时间明显短于低表达患者(χ2=10.34,P=0.0013;χ2=9.879,P=0.0017)(图3)。因此,TβR1、p-Smad2/3蛋白的表达水平可能是影响哈族食管鳞癌患者术后生存情况的重要因素。

A:TβR1蛋白表达水平与哈族食管鳞癌患者术后生存时间关系的生存曲线;B:p-Smad2/3蛋白表达水平与哈族食管鳞癌患者术后生存时间关系的生存曲线图3 TβR1和p-Smad2/3蛋白表达水平与哈族食管鳞癌患者术后生存时间关系的生存曲线Fig.3 Survival curve of the relationship between TβR1 and p-Smad2/3 protein expression levels and postoperative survival time in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma patients

3 讨论

食管癌是我国高发的恶性肿瘤之一。位于新疆北部的哈萨克族食管鳞癌发病率处于较高水平[17],有流行病学资料显示,食管癌患者的死亡率位于新疆哈族恶性肿瘤的首位。食管癌早期缺乏特异性症状,导致大部分患者首次就诊时就处于疾病的中晚期。有研究显示食管癌术后5年生存率低,其中75%的患者在确诊后1年内因浸润、转移而死亡[18]。因此,深入研究食管癌发生发展机制,对于食管癌的诊断、治疗及预后具有重要意义。

据报道,TGF-β信号通路与肿瘤发生发展相关[9]。在本研究中,我们首先通过KEGG通路富集分析对食管癌进行探索,发现TGF-β信号通路参与了食管癌的发生与发展。然后,我们对TGF-β信号通路的94个基因进行蛋白相互作用预测,并筛选出该信号通路的核心基因。分析显示,TβR1和Smad2/3在TGF-β信号通路发挥着重要作用。因此,我们对TβR1在所有肿瘤样本中的基因表达进行分析,结果发现TβR1在食管癌中高表达,且食管癌为所有肿瘤中TβR1表达较高的肿瘤之一,由此提示,TβR1可能与食管癌的发生发展密切相关。同时,我们也通过在线分析网站TIMER对TβR1和Smad2/3在食管癌中的关系进行了研究,结果表明TβR1和Smad2/3在食管癌中的表达呈正相关。

因此,本研究通过免疫组化方法检测了TβR1和p-Smad2/3蛋白在哈萨克族食管鳞癌患者中的表达情况,结果发现二者的表达均上调且正相关,这与我们通过生物信息学分析得到的结果相一致。在既往研究中,部分学者如李秋香等[19]研究发现p-Smad2/3蛋白在食管鳞癌中高表达,李冠华等[20]发现在食管鳞癌组织中Smad2蛋白的表达高于正常组织;然而也有部分学者,如何欣蓉等[21]发现p-Smad2和TβR2蛋白在食管癌中的表达低于癌旁正常组织,这可能与研究人群的选择、样本量的大小等有关。

本实验还分析了TβR1和p-Smad2/3的蛋白表达水平与食管鳞癌患者临床病理特征的关系,结果发现TβR1和p-Smad2/3蛋白高表达的哈族食管鳞癌患者,其肿瘤浸润深度和淋巴结转移明显高于低表达患者。据报道,TGF-β信号通路可通过诱导上皮-间充质转化从而促进肿瘤细胞的浸润,并促进肿瘤的转移[22-24]。有研究显示,胰腺癌组织中TβR1表达上调并促进胰腺癌的转移,其机制与TβR1能够参与调控上皮-间充质转化相关基因的表达有关[25];Cao等[26]发现TGF-β1和p-Smad3高表达促进食管鳞癌转移,由此说明TβR1和p-Smad2/3可能参与了食管鳞癌的进展。我们进一步通过Kaplan-Meier生存分析发现TβR1和p-Smad2/3高表达组生存率均较低表达组低,说明TβR1和p-Smad2/3蛋白表达水平与哈族食管鳞癌患者生存时间相关,TβR1和p-Smad2/3蛋白表达可被用来作为判断食管鳞癌患者预后的指标。

综上所述,TGF-β/Smad信号通路与哈族食管鳞癌的发生发展及预后密切相关,但其具体分子机制仍待进一步的实验研究与探讨。