马玉捷 文星星 申童 向琼昊

摘要：本调查旨在了解弓形虫病在校园流浪动物（犬、猫）体内的感染情况，于2018.9月～2022.2月期间，在湖南生物机电职业技术学院采集流浪犬、猫血清样品及粪便样品共52份，采用荧光探针法进行犬猫弓形虫病的流行病学调查。调查结果显示，阳性样品共有17份，阳性率为32.69％，其中犬样本21份，阳性样品6份，阳性率为28.57％；猫样本21份，阳性样品11份，阳性率为35.48％。

关键词：流浪动物；弓形虫；检测；荧光探针法

随着国内宠物行业的迅猛发展，社会上的流浪动物数量也与日俱增。流浪犬猫主要是指散布在城市公园、社区以及城乡接合部的无主人的犬和猫。它们主要来源于两方面：一是由被弃养的伴侣犬猫组成；二是由流浪犬猫自由交配、繁殖产生的后代[1]。流浪犬猫几乎遍布每个城市。流浪犬猫大多没有注射疫苗及驱虫，容易携带诸多病原菌、寄生虫等，从而造成疾病的传播。

犬猫弓形蟲病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人畜共患的原虫病。弓形虫几乎可以感染所有的温血动物，猫既是弓形虫的中间宿主又是其终末宿主，而人类和其他动物只是中间宿主[2]。人以及其他哺乳动物通过摄入含有感染期虫体的食物，包括生肉、蛋制品、奶制品、饮用水而感染。也可经破损皮肤、黏膜以及通过胎盘由母体垂直传播而感染。苍蝇、蟑螂以及节肢动物也可以携带并传播弓形虫卵囊[2]。其可引起妊娠期妇女流产、胎儿发育不良、死胎等，还可以引起男性不育，弓形虫是计划生育、优生优育的大敌。因此，防止弓形虫病的传播已经成为我国重要的公共卫生问题。校园宠物随着学生毕业等种种原因被遗弃在各大高校内形成一定数量的流浪动物群体。校园流浪犬猫已成为各大高校出现的共同问题。因此对校园流浪犬猫的弓形虫感染情况进行调查是对长沙城区流浪犬猫弓形虫病的流行病学调查的重要组成部分。

湖南生物机电职业技术学院内有大量流浪犬猫，由于食物和健康无法保证，其很可能感染携带弓形虫。而校园内有大量师生能够接触到流浪动物，由此可能产生一系列关系到人身健康的问题。流浪动物随地排泄，发情期易攻击人等情况，使得人与动物的矛盾冲突近年来也在不断加剧，因此，调查校园内流浪犬猫的重要人畜共患病——弓形虫携带和感染情况显得尤为重要。为全面掌握校园内流浪犬猫弓形虫的感染情况，采用荧光探针法对动物体内弓形虫特异性基因片段进行检测。

1 材料与方法

1.1 被检样品

对湖南生物机电职业技术学院校园内流浪犬猫进行血液采集或粪便采集。对于可以捕捉的39只犬猫施行捕捉麻醉后采血并做绝育手术。对于不能捕捉的动物收集其粪便进行检测。2018年9月～2022年2月期间共收集到52份样本，其中猫血清样本21，粪便样本10，犬血清样本11，粪便样本10。

1.2 样品采集

动物麻醉后无菌采集受检动物的静脉血1.0～1.5ml，离心析出血清，-20℃冷冻备用。采集动物粪便样本3～5g/份，采集后立刻放入无菌采便管内，

-20℃冷冻备用。按照试剂盒说明书操作，定性测定犬猫样本中的弓形虫基因的特异性片段。

1.3 试剂

弓形虫免核酸提取实时荧光PCR一键式试剂盒。卡尤迪生物科技有限公司，批号S2004-07Y。

1.4 仪器

CoyoteBio Mini8 plus实时荧光定量PCR仪，北京尤卡迪生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 扩增试剂准备

从试剂盒中取出TOX-PCR反应液，待其充分溶解后，振荡混匀5s，瞬时离心5s。根据所要检测的样本数，取相应份数的反应液，20μl/份，于0.2ml PCR反应管中备用。试剂用毕后立即放入-20℃保存。

1.5.2 样本处理

粪便样本处理：挑取固体粪便样本0.1g（黄豆粒大小）至400μl样本稀释液中涡旋振荡1min，13000 rpm离心10 min，取50μl上清液转移至新的1.5 ml离心管中，70℃加热2min，加热后取20μl加热处理后的样本加入2μl粪便样本裂解液混匀。加入样本裂解液，混匀处理后应立即加入PCR反应体系中。血样本处理：血清样本经样本稀释液（或生理盐水）稀释5倍后，即可直接上样；

1.5.3 加样

在分装有TOX-反应液的PCR反应管中分别加入5μl处理后的待检样本、TOX-阳性对照品或TOX-阴性对照品2μl（用3μl样本稀释液将总体积补足到25μl）。压紧管盖，瞬时离心。

1.5.4 PCR扩增

将加完样的PCR管按照相对应的位置放置到CoyoteBio Mini8 plus仪器里，等待运行。按照说明书操作仪器软件。检测结束后查看检测结果报告。

2 结果

利用实时荧光PCR（荧光探针）方法对湖南生物机电职业技术学院校园内流浪的21只犬31只猫进行了弓形虫基因特异性片段的检测，其中17动物检测为阳性，感染率为32.69%，有6犬检测结果为阳性，感染率为28.57%，有11只猫检测结果为阳性，感染率为35.48%。具体感染情况见表。

3 讨论

3.1 弓形虫的分布

弓形虫为世界性分布，在人群中感染较普遍，全世界有1/4的人口受到威胁，血清阳性率平均为25%～50%，有的高达85%以上[3]。据我国第二次寄生虫病调查显示，我国一般人群弓形虫的平均感染率在7.89%[4]，动物饲养员阳性率明显高于普通人群。兽医和屠夫在各职业中感染率最高，达9.20%和7.70%。2006年青岛市调查表明饲养宠物者弓形虫感染率为11.86%，未饲养宠物者为7.38%，饲养宠物者弓形虫感染高于未饲养宠物者[5]。2016年调查表明宠物犬和乡村犬弓形虫抗体阳性率分别为14.5 %和24.6%，流浪猫和宠物猫弓形虫抗体阳性率分别为24.1%和13.4 %[6]。2011年对长沙城区504只犬猫弓形虫的调查结果表明长沙地区犬猫弓形虫感染率较高已达24.4%[7]；

本次针对湖南生物机电职业技术学院内52只流浪犬猫进行弓形虫检测显示，流浪动物弓形虫感染率为32.69%，其中流浪犬感染率达28.57%，流浪猫感染率达35.48%。高于长沙城区家养宠物弓形虫感染率24.4%，也高于北京乡村犬抗体阳性率24.6%与流浪猫抗体阳性率24.1%以及国外Harold Salant和Spira Dan T.的调查结果16.8%[8]。这可能与本次调查的样本数量、检测方法有关。由于流浪犬猫在户外觅食，捕食鼠类、鸟类等弓形虫中间宿主，易接触到节肢动物、蚯蚓这类弓形虫卵囊携带者，其食入弓形虫包囊和卵囊的机会要比家养犬猫大得多。因此流浪犬猫弓形虫感染率高于室内饲养的犬猫。

3.2 弓形虫的检测

犬猫感染弓形虫后是否发病取决于虫株的毒力、感染数量和途径以及宿主免疫力等因素。猫对弓形虫的敏感性差，仅有少数出现临床症状。人和动物感染弓形虫多呈无症状的隐性感染，因此只能通过医学检测来确定是否感染。弓形虫病的检查分为免疫学检查和病原体检查。目前临床上主要应用是免疫学方法，包括血清特异性抗体的诊断以及血清中弓形虫循环抗原的检测[9]。已有多种血清学方法用于弓形虫病的诊断，包括间接血凝试验（IHA）、间接荧光抗体实验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法。常见弓形虫的检查指标包括（1）特异性IgM抗体：该抗体常出现在感染早期，提示近期内存在弓形虫感染，是急性期感染的标志。IgM滴度达到高峰后很快降到低水平；（2）特异性IgG抗体：感染后IgG抗体在血液中出现较晚，但达到高峰后会基本稳定在一个较高的滴度，且持续时间较长，是既往感染的标志。因此健康带虫者可长期存在IgG抗体，曾感染弓形虫而现已治愈者IgG抗体仍可持续较长时间。（3）循环抗原CAg：早期或现症感染的指标。抗原检测的灵敏性和特异性都较高，可作为确诊依据。弓形虫的病原体检测一般有三种：第一种，直接涂片法，在涂片中的细胞浆内寻找弓形虫。第二种，动物接种。第三种，细胞培养。但病原体检查操作复杂，检出率较低，动物接种和细胞培养时间较长，目前在临床应用较少，意义不大。

3.3 弓形虫的传播

动物是弓形虫的重要传染源，弓形虫在它的生活史中，除配子体外，包括滋养体、包囊和卵囊都是均具有感染性的。虫体在宿主内的形式多样，包括感染力较强的速殖子、生长缓慢感染力较差的缓殖子及卵囊等。在自然界感染最多的是猫科动物，猫既是弓形虫的中间宿主又是其终末宿主，而人类和其他动物只是中间宿主。弓形虫仅在猫体内进行有性繁殖形成卵囊，并随其粪便排出体外。校园内流浪犬猫因捡拾垃圾，捕食鼠类、鸟类等感染弓形虫。感染的猫排出弓形虫卵囊，进入环境中的卵囊经过2～4d发育成具有感染性的成熟卵囊。这些卵囊可以长期存在于外界环境中[10]。当其他动物或家养宠物接触被卵囊污染的土壤、水后易感染弓形虫。

3.4 流浪动物对弓形虫的影響

流浪犬猫的繁殖力惊人，一只流浪母猫一年产仔2胎，每胎产仔4～10只[1]。流浪犬猫大多未进行绝育手术，其大量无序繁殖导致城市流浪动物数量急剧增多。因此带来的公共卫生问题和社会问题都日益尖锐。目前，流浪犬猫问题已成为世界性的热点问题，各国对于流浪犬猫如何处理的问题也在不断探索。对于校园流浪动物的管理，一方面应借助专业学科力量为其进行绝育手术以控制数量。另一方面应定期对校园环境中的犬猫排泄物进行清理、消毒。校园内家养犬应使用引导绳牵引外出，避免犬在外捡食或接触流浪猫排泄物。家养猫应完全室内饲养，避免其捕食老鼠、蚯蚓等中间宿主。饲喂宠物商品粮，不应饲喂生肉或半熟肉。避免宠物感染弓形虫病。

犬猫作为与人类关系密切的动物，在弓形虫的传播过程中起着非常重要的作用，充分了解校园内流浪犬猫的弓形虫感染状况对该病的防控以及公共卫生具有重要的指导意义。校园流浪犬猫已成为各大高校出现的共同问题。因此对校园流浪犬猫的弓形虫感染情况进行调查是对城区流浪犬猫弓形虫感染情况调查的重要组成部分。同时对于校园内可抓捕的流浪动物进行绝育手术在很大程度上控制了流浪动物的数量以及人畜共患病的传播。

参考文献

[1] 翟云逸，王强，盛健，等.我国城市流浪犬猫安置的现状与分析[J].中国兽医杂志，2018，54（9）：116-118.

[2] 朱兴全.小动物寄生虫病学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2016.

[3] 于恩蔗.弓形虫病学（第二版）[M].北京：人民卫生出版社，1992.

[4] 王陇德.全国人体重要寄生虫病现状调查[M].北京：人民卫生出版社，2008.

[5] 孙秀芬，娄渊贵，刘鹏志，等.2006青岛市城区部分饲养宠物者弓形虫感染情况调查[J].预防医学论坛.2007，13（2）：133-134．

[6] 张启龙，傅彩霞，张玮，等.2016年北京地区犬猫弓形虫抗体检测与分析[J].动物医学进展，2017，38（10）：132-134.

[7] 唐小明，王昌建，何世成，等.长沙地区犬猫弓形虫病血清学调查[A].第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C].2013：1187-1188.

[8] 于咏兰，付丽娟，汪明.北京地区犬猫弓形虫病血清学调查[J].中国兽医杂志，2006，42（5）：7-9.

[9] 王世海.弓形虫病的免疫学诊断和疫苗研究的新进展[J].贵州医药，2005，29（4）：92-94.

[10] 孔繁瑶.家畜寄生虫学（第二版）[M].北京：中国农业大学出版社，1997.