张朋垒 张明婷 郝礼森 靳丽敏 潘恩亮 何宇 苗笑佳 王薇

肝纤维化是肝脏对各种损伤产生的修复反应,长期进展可演变为肝硬化[1]。而肝星状细胞 (hepatic stellate cells, HSC) 是参与肝纤维化的最重要细胞,其活化及增殖在肝纤维化的形成及发展中扮演重要角色[2-4]。含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2 (SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)是第一个被确定为具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶,广泛表达于人体各个组织和细胞,其过表达可通过促进肿瘤细胞的增殖参与多种恶性肿瘤的形成及发展[5-6]。近年来一些学者对SHP2在某些非肿瘤领域的作用给予了广泛关注。有研究发现[7],体外活化大鼠HSC的 SHP2表达下调可使其增殖明显受到抑制。但SHP2在纤维化肝组织及在体HSC中的表达变化与在体HSC活化及增殖的关系仍不清楚。本研究采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纤维化模型,探讨大鼠肝纤维化病程中肝组织及在体HSC的SHP2表达与在体HSC活化及增殖的关系。

材料与方法

一、实验动物及试剂

50只清洁级健康雄性 SD大鼠(350～400 g/只)购于北京华阜康生物科技股份有限公司。SP试剂购于北京中山金桥生物有限公司,兔抗 SHP2多克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司,小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白 (alpha-smooth muscle actin, α-SMA)单克隆抗体购于台湾arigo公司。

二、方法

(一)大鼠肝纤维化模型的构建 上述实验大鼠均按清洁级要求在华北理工大学动物实验室饲养,并被随机分为:对照组(10只)、模型组(40只)。大鼠肝纤维化模型采用腹腔注射四氯化碳法构建[8],将 50%的四氯化碳橄榄油混合液,经腹腔注射入模型组大鼠,每周2 次,每次剂量为1 mL/kg,共8周,并在造模 2周、4周、6周、8周分别取10只大鼠,无菌条件下麻醉后取适量肝组织,随即用4%多聚甲醛固定,用于免疫荧光、免疫组织化学、Masson三色及HE染色;对照组大鼠每周2 次腹腔注射生理盐水,剂量同模型组,肝组织标本按上述方法与8周模型组大鼠一同留取。本研究所涉及的动物实验操作经华北理工大学实验动物伦理委员会审批。

(二)肝组织病理学及免疫组织化学染色 大鼠肝组织经石蜡常规包埋、切片,进行Masson三色及HE染色,观察肝组织病理学变化。并应用SP法进行SHP2及α-SMA免疫组织化学染色,用PBS代替一抗进行阴性对照染色,结果以棕褐色为阳性表达。SHP2及α-SMA免疫组化染色图像应用Image Pro Plus 6.0软件分析,积分光密度值 (integral optical density, IOD)表示阳性表达水平。

(三)SHP2与α-SMA免疫荧光双标记检测在体HSC的SHP2表达 常规脱蜡及水化的大鼠肝组织切片经抗原修复及血清封闭后,加入一抗小鼠抗α-SMA 单克隆抗体及兔抗SHP2多克隆抗体(均为1∶100稀释)于4 ℃冰箱中过夜,用PBS清洗,5 min/次,共3次;先后滴加异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG(1∶100稀释)二抗及四甲基异硫氰酸罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200稀释)三抗,在滴加二抗与三抗之间及三抗之后,分别于37 ℃恒温箱中内孵育30 min,并用PBS清洗3次,5 min/次;最后滴加DAPI避光孵育10 min染核。用PBS代替一抗进行阴性对照染色。在激光扫描共聚焦显微镜下观察肝组织的SHP2与α-SMA共表达。

三、统计学方法

结 果

一、大鼠肝组织的病理组织学变化

HE及Masson三色染色显示大鼠肝纤维化模型成功构建,随着造模时间延长,正常肝细胞由于不同程度变性坏死而逐渐减少,肝纤维化逐渐加重(图1)。

A:对照组HE染色;B:造模4周HE染色;C: 造模8周HE染色;D: 对照组Masson染色;E:造模4周Masson染色;F: 造模8周Masson染色

二、在体HSC的活化与增殖

α-SMA在对照组大鼠肝组织中仅表达于血管壁平滑肌细胞,与对照组大鼠肝组织的α-SMA阳性表达IOD相比,造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的α-SMA阳性表达IOD显著增加(P<0.05),且逐渐升高,P<0.05 (图2、表1)。由于α-SMA 为HSC的活化标志,检测肝组织的α-SMA表达水平可间接反映肝组织的在体HSC活化及增殖。故上述结果显示,随着大鼠肝纤维化的加重,在体HSC的活化及增殖逐渐加快。

表1 各组大鼠肝组织的SHP2及α-SMA蛋白阳性表达IOD比较(±s, n=10)

A:对照组;B:造模2周;C:造模4周;D:造模6周;E:造模8周

三、在体HSC的SHP2表达

SHP2与α-SMA免疫荧光双标记检测显示,四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化过程中,伴随肝纤维化的加重,造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织中表达SHP2的活化HSC占总的活化HSC的百分比(54%±3%、 62%±2%、73%±4%、 86%±3%)逐渐升高(P<0.05,见图3)。

A1、A2、D1、D2: 造模2周、4周、6周、8周大鼠肝组织的SHP2阳性表达(绿色荧光斑点);B1、B2、E1、E2: 造模2周、4周、6周、8周大鼠肝组织的α-SMA阳性表达(红色荧光斑点);C1、C2、F1、F2: 造模2周、4周、6周、8周大鼠肝组织的SHP2和α-SMA共表达(黄色荧光斑点,即在体活化HSC的SHP2表达)

四、大鼠肝组织的SHP2表达

造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的SHP2阳性表达IOD较对照组显著增加(P<0.05),且逐渐升高,P<0.05(图4、表1)。

A: 对照组;B: 造模2周; C:造模4周;D: 造模6周;E: 造模8周

五、SHP2表达与在体HSC活化及增殖的相关性分析

Pearson’s相关性分析发现,在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中,不仅肝组织的SHP2免疫组织化学染色结果与肝组织的α-SMA免疫组织化学染色结果呈显著正相关(r值为0.952,P<0.05),而且肝组织中表达SHP2的活化HSC占总的活化HSC的百分比也与肝组织的α-SMA免疫组织化学染色结果呈显著正相关(r值为0.953,P<0.05)。如上所述,α-SMA为活化HSC的标志,肝组织的α-SMA表达水平间接反映在体HSC的活化及增殖。故上述分析结果提示,在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中,肝组织及在体HSC的SHP2表达均与在体HSC的活化及增殖呈显著正相关。

讨 论

SHP2是具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶[5],其在多种恶性肿瘤,如宫颈癌、乳腺癌、口腔癌及肺癌组织中过表达,并可通过促进这些肿瘤细胞的增殖参与上述肿瘤的形成与发展[9-14]。而对于SHP2在一些非肿瘤性疾病病理过程的表达变化及其作用,有研究发现,SHP2过表达可促进在心肌纤维化中起重要作用的心肌成纤维细胞增殖,这提示SHP2过表达可能参与了心肌纤维化[15];另有研究显示,体外活化大鼠HSC的SHP2表达下调可使其增殖受到明显抑制[7],而HSC是参与肝纤维化的最重要细胞,这提示SHP2可能通过影响HSC增殖参与肝纤维化。本研究显示,四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化肝组织的SHP2表达随着肝纤维化的加重逐渐升高。这表明SHP2不仅在多种恶性肿瘤组织中表达升高,在纤维化肝组织中表达也明显升高,其表达水平与肝纤维化程度一致。但在肝纤维化过程中随着纤维化程度的加重,作为肝脏主要固有细胞的肝细胞的数量由于其不断的变性坏死而逐渐减少,这提示纤维化肝组织中SHP2表达逐渐升高可能与肝纤维化过程中HSC的SHP2表达变化有关。由于α-SMA为活化HSC的标志,本研究应用SHP2与α-SMA免疫荧光双标记技术检测大鼠纤维化肝组织中在体活化肝星状细胞的SHP2表达。通过检测发现,在大鼠肝纤维化过程中伴随肝纤维化的进展,纤维化肝组织中表达SHP2的活化HSC占总的活化HSC百分比逐渐升高。这提示在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中,肝组织的SHP2表达逐渐升高与表达SHP2的活化HSC逐渐增多有关。

如上所述,α-SMA 为HSC的活化标志,检测肝组织的α-SMA表达水平可间接反映肝组织的在体HSC活化及增殖。本研究应用免疫组织化学染色检测了大鼠纤维化肝组织中α-SMA的表达变化,结果显示,肝组织的α-SMA表达随着肝纤维化的进展逐渐升高,即随着肝纤维化程度加重大鼠肝组织中在体HSC的活化及增殖逐渐加快。通过Pearson’s相关性分析发现,在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中,肝组织及在体HSC的SHP2表达均与在体HSC的活化及增殖呈显著正相关。结合SHP2在多种肿瘤中表达上调并促进肿瘤细胞增殖[9-14],以及已有研究发现,体外活化大鼠HSC的SHP2表达下调其增殖受到显著抑制[7],本研究提示,肝组织及在体HSC的SHP2表达升高可能通过使HSC的活化及增殖加快参与了肝纤维化病理过程。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。