史聪丽 沈涯 徐志国 华锋 刘乐锋 杜为

【关键词】 自然杀伤（NK）细胞；抗肿瘤机制；NK细胞受体；NK细胞过继免疫疗法；免疫检查点抑制剂；NK细胞衔接器

中图分类号：R73；R730.5   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.014

NK细胞起源于造血干细胞，依赖骨髓或胸腺微环境分化、发育成熟，是参与固有免疫应答的主要效应细胞，在杀伤肿瘤细胞时无需预先致敏，不依赖抗体与补体结合且不受主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）限制性。NK细胞通过与活化受体和抑制受体的结合调控正向和负向信号平衡，活化的NK细胞分泌T-bet、 EOMES（Eomesodermin）、IgG低亲和力Fcγ Ⅲ受体（CD16）、细胞因子、颗粒酶和穿孔素等介导肿瘤细胞凋亡，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和免疫调节作用。本文概述NK细胞抗肿瘤机制、方法和NK细胞免疫治疗的最新进展及趋势，旨为肿瘤患者的临床治疗提供思路和方法。

1 NK细胞杀伤靶细胞机制

NK细胞无需致敏直接溶解肿瘤细胞，通过不同机制介导，主要有以下几个方面。（1）穿孔素/颗粒酶途径：NK细胞释放颗粒酶和穿孔素，穿孔素直接在靶细胞膜上形成跨膜通道，增加细胞膜通透性，引起靶细胞裂解［1］，是清除突变肿瘤细胞的一个重要途径。（2）死亡配体途径：NK细胞通常表达3种死亡配体：Fas配体（FasL）、TNF配体和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL），通过与肿瘤细胞表面相应死亡受体结合引起细胞凋亡［2］。（3）细胞因子途径：NK细胞能分泌多种细胞因子，如干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等。IFN-γ能抑制肿瘤细胞增殖，阻断肿瘤血管形成及上调细胞MHC分子表达而刺激抗原提呈等；TNF-α活化靶细胞核酸内切酶，降解DNA，引起程序性细胞死亡；IL-2刺激NK细胞增殖，增强其杀伤活性［3］。（4）ADCC途径：NK细胞表达的CD16与靶细胞的IgG Fc段结合，通过信号传导使其活化，进而杀伤靶细胞［4］。IL-2和IFN-γ明显增强NK细胞的ADCC作用，而后表达Fas通过死亡配体机制诱导细胞凋亡。

2 NK细胞受体与功能

NK细胞在抗肿瘤以及免疫监视中发挥至关重要的作用。NK细胞固有免疫应答的启动是由其表面抑制受体和活化受体的相互协调与平衡所调控。正常情况下，抑制受体与自身MHCⅠ类分子结合，抑制NK细胞活化；而肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达降低或缺失，活化受体与配体结合激活NK细胞发挥ADCC作用及释放细胞因子。抑制受体主要包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like recepter，KIR）、CD94/NKG2A等，胞内信号转导是由其胞质区的免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）所介导，与配体结合后使ITIM发生磷酸化并募集SHP-1/2磷酸酶，抑制NK细胞活性［5］。活化受体主要包括NKG2D和自然细胞毒受体（natural cytotoxicity receptors，NCRs）等，通过与对应衔接蛋白的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）相互作用来启动胞内信号转导，与配体结合后使ITAM发生磷酸化，募集Syk和ZAP-70等酪氨酸激酶，提供活化信号［6］。NKG2D还可以通过与DAP10相结合磷酸化来激活PI3K/Grb-2信号途径［7］。无论是活化受体还是抑制受体，都是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。

3 NK细胞过继免疫治疗

NK细胞过继免疫疗法是指将体外激活扩增的NK细胞回输到肿瘤患者体内，从而能够发挥直接或间接的肿瘤杀伤作用，在抗肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用，主要包括自体和同种异体NK细胞过继免疫治疗。临床使用NK细胞过继免疫治疗安全、无毒副作用［8-9］，在血液肿瘤和实体瘤均有广泛应用。

NK细胞过继治疗肿瘤在临床中取得一定成果，但也存在一些问题，如NK细胞对肿瘤细胞的识别精准度不足等。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor）NK细胞（CAR-NK）疗法通过基因工程修饰以增强NK细胞靶向性和杀伤功能，有助于改善肿瘤免疫治疗的效果。CAR-NK在克服当前NK细胞肿瘤免疫治疗中一些缺陷的同时，还显示出优于CAR-T细胞的诸多优势：首先，NK细胞不受MHC限制和具备更多肿瘤杀伤途径，使CAR-NK细胞具有更强的肿瘤杀伤毒性和更高的靶向特异性［10］；其次，异体NK细胞不引起GVHD，不引发细胞因子释放综合征（CRS），体内存活周期短，确保细胞治疗的安全性［11］；再次，细胞来源广泛，包括外周血、脐带血、NK细胞系（NK-92）、人胚胎干细胞（hESC）及诱导多能干细胞（iPSC）等，可以弥补患者自身免疫细胞弱化的缺点，实现批量生产［12］。

LI等［13］用iPSC衍生的NK细胞制备表达NKG2D和2B4的CAR-NK细胞（NK-CAR-iPSC-NK cell），研究证实在小鼠体内其杀伤卵巢癌细胞的能力显著优于未经修饰的外周血及iPSC来源NK细胞，相较表达T细胞受体结构的CAR-NK细胞也显示出更强的杀伤能力。REZVANI教授团队［14］利用脐血（CB）来源的NK细胞（CB-NK）制备表达CD19 CAR、IL-15和诱导型caspase 9安全开关的iC9/CAR.19/IL-15 CB-NK细胞，该细胞通过自分泌IL-15促进CAR-NK细胞自我增殖。在前期的细胞系和小鼠体内试验中证实该细胞杀伤CD19阳性慢性淋巴细胞白血病细胞和Raji细胞的能力显著优于未经转染的脐血NK细胞。2020年该研究团队［15］应用iC9/CAR.19/IL-15 CB-NK细胞对复发难治CD19阳性非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病患者进行Ⅰ/Ⅱ期临床研究，结果显示大多数患者产生了临床响应，且未出现主要的毒性作用。CAR-NK细胞疗法采用CAR-T疗法研发思路的同时，又可以发挥NK细胞独特的生物学特性，在血液肿瘤和实体瘤治疗中表现出较大的潜力，虽然目前還处于临床研究阶段，但未来CAR-NK细胞疗法将很大可能成为肿瘤免疫治疗的一个有力策略。

4 NK细胞和免疫检查点抑制剂联合疗法

2018年诺贝尔生理学或医学奖授予TASUKU HONJO和JAMES P·ALLISON，两人因在抑制消极免疫调节机制的研究中发现了新癌症疗法而获奖。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）抗体的临床应用正在颠覆癌症的治疗观念。免疫检查点是机体内存在的免疫抑制信号分子，通过调节共刺激和共抑制信号来发挥免疫调节作用［16］。阻断NK细胞表面的免疫检查点是肿瘤免疫治疗的关键。NK细胞抑制受体也被称为检查点受体，是肿瘤免疫疗法中最具前景的治疗靶标。目前靶向程序性死亡受体/配体1（PD-1/PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）的单克隆抗体治疗方法在临床上应用较为广泛［17-19］。有研究［20］表明活化的NK细胞表达PD-1，其阻断后显著增强NK细胞的杀瘤活性。针对NK细胞联合PD-1临床治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的缓解率大幅提升，安全性及耐受性良好［21］，已充分显示NK细胞与ICIs联合治疗方法的可行性和安全性。设计合理的联合治疗方案，以更大程度提高治疗效益，将开启肿瘤免疫治疗的新途径。

5 NK细胞衔接器

双特异性或三特异性抗体是指以单克隆抗体结构为骨架，经过工程化改造得到靶向两个或三个肿瘤抗原或效应细胞受体的工程化抗体［22］。与普通单克隆抗体不同，这些融合蛋白可以被设计成与多种不同的肿瘤抗原和NK受体相结合，在直接靶向肿瘤细胞的同时可有效激活NK细胞并增强其细胞毒性和细胞因子产生，赋予NK细胞治疗不同肿瘤类型的能力。CD16是目前应用最多的用于识别NK细胞的双特异或三特异性抗体的靶点［23］。美国MD安德森癌症中心的研究［24］显示，CB-NK结合靶向CD16a和CD30的先天细胞衔接蛋白（innate cell engager，ICE）AFM13，对于CD30+淋巴瘤细胞具有强大的抗肿瘤活性。近期，该中心在AACR会议上公布了使用CB-NK联合AFM13（CD16/CD30）治疗淋巴瘤的初步临床试验结果，患者接受AFM13联合CB-NK细胞治疗后达到100%的客观缓解率和62%的完全缓解率。Cytovia Therapeutics公司公布了iPSC衍生的NK细胞联合多特异性NK细胞衔接抗体CYT-303治疗肝细胞癌的临床前结果，CYT-303与iNK的联用在肝细胞癌模型中表现出比iNK单药疗法更积极的体外和体内抗癌活性，为治疗肝细胞癌的临床开发提供了有力支持。

6 调节因子和创新生物标志物

ZHOU等［25］发现microRNA （miRNA）是NK细胞介导的免疫监控过程中的重要调节因子。信号传导与转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）是miR-130a的靶点，miR-130a高表达增强了NK细胞对A549细胞的杀伤能力，STAT3高表达使miR-130a诱导的NK细胞对NSCLC细胞杀伤活性失效。体外研究IL-2激活的NK-92细胞中miR-130a显著高表达，STAT3低表达，因此IL-2为进一步研究miR-130a在NK细胞免疫治疗多种癌症的作用和分子机制奠定基础。

NI等［26］发现抑制缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）能增强NK细胞活性，HIF-1α的条件性缺失导致肿瘤生长减慢，激活标志物、效应分子表达增加，细胞核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）途徑富集；且HIF-1α低表达与人肿瘤浸润性NK细胞IFN-γ（IFNG）的高表达相关，实体瘤中丰富的NK-IL18-IFNG信号与患者总体生存率上升相关。抑制转录因子HIF-1α的靶向治疗方法有望改善NK细胞敏感性实体肿瘤的治疗策略。

YOUN等［27］研究显示，NSCLC患者外周血中NK细胞与凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1多核型髓源性抑制细胞（Lox-1+PMN-MDSCs）的比值（NK cell-to-Lox-1+ PMN-MDSC ratio，NMR）可作为评估抗PD-1反应的预测生物标志物，第一轮Nivolumab治疗后应答者中NMR明显高于无应答者。通过生物信息学、计算机分析等新方法建立综合的生物标志物筛查体系可以更加全面地预测免疫检查点抑制剂疗效，选择更有可能从免疫检查点抑制剂治疗中受益的患者，从而推动肿瘤精准医学的发展。

7 智能化NK细胞疗法

展望未来，NK细胞疗法将逐渐走向“通用型+货架式+定制式”的供应模式［28］，实现NK细胞疗法的人工智能化。NK细胞来源广泛，可成为“通用型”的底盘细胞；然后经过体外基因工程修饰改造，进行大规模扩增，实现NK细胞的“货架式”供应模式；当有患者需要进行治疗时，结合生物标志物的筛查结果，在数据库中匹配最有可能产生应答的免疫细胞产品，“定制”最合适患者的治疗方案，快速地将产品复苏并提供给患者进行临床使用。可以预期，NK细胞“通用型+货架式+定制式”的供应模式正在探索免疫治疗在未来更多的可能性。

8 结语

NK细胞免疫疗法毒副作用小、抗肿瘤持久、启动多重免疫应答、显著提高患者生存质量。随着CAR-NK技术、免疫检查点抑制剂和NK细胞衔接器等药物的开发应用，NK细胞疗法已逐渐成为肿瘤免疫治疗的新兴主力军。为患者制定更为精准和合理的联合免疫治疗方案是NK细胞肿瘤免疫治疗成功的关键所在。未来仍需大量的努力和临床试验研究为设计联合治疗方案提供支持，更大限度提高肿瘤治疗的效益。

参 考 文 献

［1］  LIU S Z， GALAT V， GALAT Y， et al. NK cell-based cancer immunotherapy：from basic biology to clinical development［J］. J Hematol Oncol， 2021， 14（1）：7.

［2］  POCKLEY A G， VAUPEL P， MULTHOFF G. NK cell-based therapeutics for lung cancer［J］. Expert Opin Biol Ther， 2020， 20（1）：23-33.

［3］  黃庆生，李琦，黄勇，等.人NK细胞体外高效扩增的实验研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2008，24（12）：1167-1169.

［4］  ZENG Y Q， LV X Z， DU J. Natural killer cell-based immunotherapy for lung cancer：challenges and perspectives （Review）［J］. Oncol Rep， 2021， 46（5）：232.

［5］  PURDY A K， CAMPBELL K S. Natural killer cells and cancer：regulation by the killer cell Ig-like receptors （KIR）［J］. Cancer Biol Ther， 2009， 8（23）：2209-2218.

［6］  CHEN Y Y， LU D， CHUROV A， et al. Research progress on NK cell receptors and their signaling pathways［J］. Mediators Inflamm， 2020， 2020：6437057.

［7］  LIU H F， WANG S J， XIN J， et al. Role of NKG2D and its ligands in cancer immunotherapy［J］. Am J Cancer Res， 2019， 9（10）：2064-2078.

［8］  TANAKA J， MILLER J S. Recent progress in and challenges in cellular therapy using NK cells for hematological malignancies［J］. Blood Rev， 2020， 44：100678.

［9］  XIE S L， WU Z Y， NIU L Z， et al. Preparation of highly activated natural killer cells for advanced lung cancer therapy［J］. Onco Targets Ther， 2019， 12：5077-5086.

［10］  PFEFFERLE A， HUNTINGTON N D. You have got a fast CAR：chimeric antigen receptor NK cells in cancer therapy［J］. Cancers （Basel）， 2020， 12（3）：706.

［11］  MARTN-ANTONIO B， SUE G， PEREZ-AMILL L， et al. Natural killer cells：angels and Devils for immunotherapy［J］. Int J Mol Sci， 2017， 18（9）：1868.

［12］  FANG F， XIAO W H， TIAN Z G. NK cell-based immunotherapy for cancer［J］. Semin Immunol， 2017， 31：37-54.

［13］  LI Y， HERMANSON D L， MORIARITY B S， et al. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity［J］. Cell Stem Cell， 2018， 23（2）：181-192. e5.

［14］  LIU E， TONG Y， DOTTI G， et al. Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity［J］. Leukemia， 2018， 32（2）：520-531.

［15］  LIU E L， MARIN D， BANERJEE P， et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors［J］. N Engl J Med， 2020， 382（6）：545-553.

［16］  CHEN L P， FLIES D B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co-inhibition［J］. Nat Rev Immunol， 2013， 13（4）：227-242.

［17］  ARMAND P， LESOKHIN A， BORRELLO I， et al. A phase 1b study of dual PD-1 and CTLA-4 or KIR blockade in patients with relapsed/refractory lymphoid malignancies［J］. Leukemia， 2021， 35（3）：777-786.

［18］  GRAY J E， VILLEGAS A， DANIEL D， et al. Three-year overall survival with durvalumab after chemoradiotherapy in stage Ⅲ NSCLC—update from PACIFIC［J］. J Thorac Oncol， 2020， 15（2）：288-293.

［19］  PANDEY Y， MATIN A， BROADFOOT B， et al. Clinical and histo-logical response to combination nivolumab and ipilimumab in metastatic renal cell carcinoma［J］. Proc （Bayl Univ Med Cent）， 2020， 33（2）： 258-260.

［20］  SHI L， CHEN S H， YANG L J， et al. The role of PD-1 and PD-L1 in T-cell immune suppression in patients with hematological malignancies［J］. J Hematol Oncol， 2013， 6（1）：74.

［21］   LIN M， LUO H H， LIANG S Z， et al. Pembrolizumab plus allogeneic NK cells in advanced non-small cell lung cancer patients［J］. J Clin Invest， 2020， 130（5）：2560-2569.

［22］  方芳，肖衛华，田志刚.NK细胞肿瘤免疫治疗技术的挑战［J］. 中国肿瘤生物治疗杂志，2018，25（1）：1-8.

［23］  ROTHE A， SASSE S， TOPP M S， et al. A phase 1 study of the bispecific anti-CD30/CD16A antibody construct AFM13 in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma［J］. Blood， 2015， 125（26）：4024-4031.

［24］  KERBAUY L N， MARIN N D， KAPLAN M， et al. Combining AFM13， a bispecific CD30/CD16 antibody， with cytokine-activated blood and cord blood-derived NK cells facilitates CAR-like responses against CD30+ malignancies［J］. Clin Cancer Res， 2021， 27（13）：3744-3756.

［25］  ZHOU X H， LIU S S， LIU J， et al. MicroRNA-130a enhances the killing ability of natural killer cells against non-small cell lung cancer cells by targeting signal transducers and activators of transcription 3［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2020， 523（2）：481-486.

［26］  NI J， WANG X， STOJANOVIC A， et al. Single-cell RNA sequencing of tumor-infiltrating NK cells reveals that inhibition of transcription factor HIF-1α unleashes NK cell activity［J］. Immunity， 2020， 52（6）：1075-1087. e8.

［27］  YOUN J I， PARK S M， PARK S， et al. Peripheral natural killer cells and myeloid-derived suppressor cells correlate with anti-PD-1 responses in non-small cell lung cancer［J］. Sci Rep， 2020， 10（1）：9050.

［28］  毕嘉成，田志刚.合成免疫学与未来NK细胞免疫治疗［J］. 合成生物学，2022，3（1）：22-34.

（收稿日期：2022-08-12 修回日期：2022-09-06）

（编辑：潘明志）