刘有民, 孙 超, 张培竹, 米 超, 周 超, 汪 骞, 林良斌

(1.云南农业大学农学与生物技术学院, 昆明 650201;2.云南省罗平县农业技术推广中心, 云南 曲靖 655800)

油菜是我国重要的油料作物,菜籽油和油菜籽的生产对我国油脂油料市场影响巨大[1]。研究表明,油菜种子含油量是受母体基因型、胚基因型、细胞质基因型等遗传效应和田间环境因素影响的复杂数量遗传性状[2-4]。目前,关于此方面的研究均来自田间数据分析,而含油量是综合因素影响的结果,不能很好地反映单因素对含油量的影响。而利用胚离体培养技术,不仅可以排除田间环境因素的影响,还可以排除母体效应(母体组织角果皮)影响,从而能很好地研究胚效应及正反交种子的细胞质效应,所以建立油菜离体胚维持胚性生长的培养体系是独立研究油菜种子含油量某种效应的关键。姜娇等[5]采用胚挽救技术,将甘蓝型油菜细胞质雄性不育系(Ogura CMS)的恢复基因转至甘蓝Ogura CMS材料上, 获得Ogura CMS甘蓝与甘蓝型油菜的种间杂种。赵艳艳等[6]将结球甘蓝与含根肿病抗性基因CCR的人工合成油菜杂交,通过对杂交后代胚挽救,获得了抗根肿病的甘蓝新材料。以上研究均是通过胚离体培养来获得其再生植株,不需要维持胚性生长。Avjioglu,Knox等[7]和邓林彬等[8]以胚的油脂含量及胚干重来确定胚离体培养的最佳体外培养体系,虽然提到了甘蓝型油菜离体培养胚的胚性生长状况,然而并未阐述维持胚性生长的最佳条件。本研究以甘蓝型油菜ZY 511第22 DAP(Days after pollination)幼胚为研究材料,探索胚离体培养的影响因素,建立油菜胚离体培养最佳胚性生长体系,为油菜种子含油量的遗传机制研究提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为甘蓝型油菜ZY 511,含油量为51%。2021年10月5日播种于云南农业大学后山实验基地(102° E,25° N,海拔1 945 m),株距为0.25 m,行距为0.40 m,每行6株,共20行。

取材时挑选ZY 511第22 DAP主花序上的新鲜角果,长度大小要尽量一致,剥取其幼胚进行离体培养。

1.2 方 法

1.2.1种子胚剥取及离体培养

将田间选取的新鲜角果立即带回组培室,置于超净工作台上进行灭菌处理。用无菌水浸洗3次,每次5 min,随后用75%乙醇浸泡3 min,然后用无菌水冲洗5 min后用0.1%升汞消毒15 min,最后用无菌水浸洗3次,每次5 min。将消毒完的角果置于无菌滤纸上吸干角果皮上的水分,剥取种子,用无菌的尖头镊子戳破幼嫩种皮,取出完整胚接种于固体培养基上。在每个直径9 cm的培养皿内放置24个离体胚,3次重复。培养皿置于光照培养箱中,光照强度设置为40 μmol/(m2·s),温度设置为24 ℃,以16 h光照8 h黑暗的光周期进行培养。体外培养20 d后测定其胚性生长率。

1.2.2培养基筛选

本实验选用MS、B 5和N 6培养基作为初始培养基,三者均为不含蔗糖和琼脂的粉末状培养基。3种培养基配制过程为:分别称取MS培养基4.74 g、B 5培养基3.21 g、N 6培养基3.99 g,蔗糖浓度6%,琼脂浓度0.4%,加入1 L蒸馏水,配制成3种不同的固体培养基,调节pH值为 5.8,于高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min后冷却至45 ℃左右进行倒平板。将剥取的幼胚进行离体培养,对在不同培养基培养下的生长状况进行比较,得出最适培养基,再进行后续实验筛选。

1.2.3蔗糖浓度筛选

在最适培养基中添加蔗糖进行重新筛选。分别设置4%,6%,8%,10%,12%等5个蔗糖浓度处理,琼脂浓度4%,配制成5种不同的固体培养基,测定不同浓度的蔗糖对离体幼胚的胚性生长的影响,确定最适蔗糖浓度。

1.2.4琼脂浓度筛选

在最适培养基+最适蔗糖浓度的培养基中设置5个琼脂浓度,分别添加0.4%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%的琼脂,研究不同浓度的琼脂对离体幼胚的胚性生长的影响,用以确定最适琼脂浓度。

1.2.5激素浓度配比筛选

在得到最适培养基+最适蔗糖浓度+最适琼脂浓度后,以新获得的培养基为基础培养基,加入不同浓度的NAA(0,0.05,0.10,0.15 mg/L)和6-BA(0.05,0.10,0.15,0.20 mg/L),这两种激素共设置了16种激素浓度配比组合,通过对培养基中不同浓度配比对离体幼胚的胚性生长影响的检测,筛选这两种激素的最适浓度配比组合。

1.3 实验数据处理

采用Microsoft Office Excel 2010和IBM SPSS Statistics 26软件处理数据。

胚性生长率/%=(胚性生长胚数/胚总数)×100%;

愈伤组织率/%=(愈伤组织胚数/胚总数)×100%;

生根率/%=(生根胚数/胚总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对油菜离体培养胚胚性生长的影响

油菜胚离体培养中,培养基为离体胚的生长所需提供了各种营养物质,而合适的培养基对离体胚的生长至关重要。本研究以B 5、MS和N 6培养基为基础培养基,对甘蓝型油菜22 DAF种子进行20 d胚离体培养和生长状况分析。结果显示,在不同培养基中的胚均出现子叶片增大,子叶柄伸长和膨大状况,但胚的生长状况差异较明显(图1)。B 5中大部分胚能维持胚性生长状态,只有部分胚有愈伤组织出现,胚性生长率达89.06%,显著高于N 6和MS培养基,胚的愈伤率、生根率均显著低于N 6和MS培养基。在N 6和MS中均出现胚早熟萌发现象,部分子叶片发生卷曲,有愈伤组织出现,子叶柄有白色根毛长出。在N 6中胚出现愈伤组织的情况较多(39.06%),显著高于MS和B 5。而在MS中胚的子叶柄生根现象较严重,根毛多,根须长,生根率高达47.40%(表1)。综上可知,B 5培养基为油菜离体胚培养的最适培养基。

表1 不同培养基对离体培养胚的胚性生长的影响

注:图中蓝色圈内出现愈伤组织,红色圈内出现生根,白色圈内两者皆出现。

2.2 不同蔗糖浓度对油菜离体培养胚的胚性生长的影响

胚离体培养需要蔗糖作为碳源为其提供能源物质,同时蔗糖还能为离体培养的胚提供稳定的渗透压来维持胚胎的正常生长和发育。由表2可见,随着蔗糖浓度增加,胚的胚性生长率呈先升后降趋势,8%时离体培养胚的胚性生长率最大,其他蔗糖浓度均低于8%。4%时离体培养胚容易早熟萌发成幼苗,子叶柄会有大量白色根毛产生,胚性生长率最低(79.76%),因此,最适蔗糖浓度为8%。

表2 不同蔗糖浓度对离体培养胚的胚性生长的影响

2.3 不同琼脂浓度对油菜离体培养胚的胚性生长的影响

油菜种子在发育过程中尤其是在发育早期,未成熟种子的幼胚处于液态的胚乳中,胚生长的环境属于一种半液态环境。为了探索这种半液态环境下的最适胚离体培养条件,在B 5+8%蔗糖的培养基基础上设计了5个琼脂浓度进行油菜胚离体培养。结果(表3)表明,随着琼脂浓度升高,离体培养胚的胚性生长率呈先升后降的趋势,琼脂浓度为0.6%时胚的胚性生长状况最好,达92.19%。所以,选择0.6%作为维持胚离体培养胚性生长的最适琼脂浓度。

表3 不同琼脂浓度对离体培养胚的胚性生长的影响

2.4 不同激素浓度配比对油菜离体培养胚的胚性生长的影响

油菜组织培养体系中,影响外植体生长发育的一个重要因素是培养基中外源激素的组成,本实验在重新确定了最适蔗糖浓度(8%)和琼脂浓度(6%)后的B 5培养基中,加入不同浓度配比的NAA和6-BA,探究两种激素利于油菜胚离体培养最适浓度配比。结果显示,胚离体培养10 d左右胚的子叶生长迅速,20 d时胚的子叶片均明显增大、增厚且颜色变绿,子叶柄伸长且略有膨大,但也出现个别胚在接种后变黄、变褐或者停止生长现象,且不同配比组合离体培养胚的子叶片弯曲程度不同,子叶片颜色及子叶柄生长状态也有所区别。与其他配比处理相比,P 7培养基中胚的胚性生长状况最好,子叶片颜色较鲜绿,胚性生长率最高,达94.64%(表4)。综合不同配比处理得到的胚性生长率,以P 7(0.05 mg/L NAA和0.15 mg/L 6-BA)激素配比作为胚离体培养胚性生长的最适浓度激素配比组合。

表4 不同激素浓度配比对离体培养胚的胚性生长的影响

3 讨论与结论

培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质,也是细胞生长和繁殖的生存环境。培养基种类很多,不同类型的培养基成分差异明显,对甘蓝型油菜胚离体培养所产生的影响也不同。本研究选用B 5、N 6和MS培养基进行甘蓝型油菜幼胚离体培养,观察其生长状况。结果显示,甘蓝型油菜幼胚在B 5培养基上培养更利于胚的胚性生长,在N 6和MS培养基上胚性生长状况较差,胚在非胚性生长状态下更容易出现早熟萌发及生根现象,这种现象与培养基自身的营养物质组成密切相关。MS和N 6培养基都含有较高浓度的硝酸盐和铵盐,尤其是MS培养基,在不添加其他有机成分的情况下,无机养分的含量也足以满足植物细胞生长发育营养需求,但甘蓝型油菜幼胚更适宜在铵盐含量较低及钾盐含量较高的培养基中维持其胚性生长。1968年,Gamborg等[9]在研究大豆根细胞时初次设计使用了B 5培养基,之后许多研究也表明B 5培养基是双子叶植物离体培养最适培养基。于新杰[10]研究发现,B 5培养基中木兰种子发芽率较高,褐化率最低,是最佳培养基;邓林彬等[8]在甘蓝型油菜胚离体培养研究中发现,B 5培养基中胚胎形态变化较小,基本维持胚性生长状态,胚根出现生长延伸、长根毛的现象极少,更适合作为胚培养基础培养基。本研究结果与之一致。综上表明,B 5培养基是研究油菜胚离体培养胚性生长的最适培养基。

胚离体培养时对培养环境要求较高,胚在维持其胚性生长状态时需要合适的渗透压和稳定的能量来源及无菌环境。蔗糖除作为培养基内的主要碳源和能源外对维持培养基的渗透压也起重要作用,不但为胚离体培养提供了生长发育所需能量,而且形成的渗透压也能长时间保持相对稳定,不易造成细胞脱水而影响生长,也在一定程度上减少了微生物的污染。王芸等[11]、张倩云等[12]研究表明,蔗糖浓度和渗透压都制约着幼胚的胚性生长及萌发后的生长。所以,在胚离体培养中,幼胚离体培养需要人为创造一个较高的渗透压环境来维持幼胚的胚性生长。Liu等[13]对两个不同含油量的油菜品系的不同发育阶段果皮和胚珠中的蔗糖浓度进行测定,结果发现,果皮蔗糖含量为3.98%～4.48%,胚珠蔗糖含量为5.26%～6.51%。Avjioglu等[7]通过甘蓝型油菜幼胚培养研究发现,胚胎干重会随着蔗糖浓度的增高而降低,当蔗糖浓度为2%时,幼胚早期萌发现象严重,当蔗糖浓度为10%时,幼胚早萌被抑制,维持其胚性生长。本实验设置了5个蔗糖浓度梯度,最终确定了蔗糖浓度为8%时离体幼胚的胚性生长最好。但也发现过高的蔗糖浓度会造成培养基渗透压失衡,导致幼胚脱水,影响其正常胚性生长。

油菜是双子叶植物,具有无胚乳型种子,主要由胚和种皮两部分构成。种子的胚乳在发育早期为液态,未成熟种子中的胚在这种由种皮包裹的半液态环境下以胚乳为养分不断吸收胚乳进行生长发育,当种子成熟后胚乳便会消失[14-15]。所以为胚的正常生长发育创造一种相对的半液态环境对胚的生长发育至关重要。琼脂作为一种很好的固化剂,琼脂浓度不仅决定了培养基的软硬程度及表层水分含量,也间接影响了这种人为创造的半液态环境下胚的生长发育状况。本研究设置了5个琼脂浓度梯度,通过胚生长状况的测定确定了当培养基琼脂浓度在0.6%时为最佳,此时胚能保持较好的胚性生长状态。

自1937年,White在组织培养中加入IAA起,植物激素对组织培养的调控作用就引起了人类的广泛关注。添加外源植物激素对离体培养外植体的细胞分化和形态建成有明显的调节作用,而且不同种类的植物激素对植物外植体产生的效果不同。虽然植物本身就存在内源激素且激素水平会不断发生变化,但外源植物激素的施加会直接影响和改变着外植体内源激素的水平,起到调控植物组织生长发育的作用。郭婷婷等[16]和杨长友等[17]研究也表明,植物外源激素在油菜组织培养中起着重要的作用。本试验结果显示,高浓度NAA不利于甘蓝型油菜胚性生长,胚性生长对NAA的浓度较敏感;以0.05 mg/L NAA和0.1 mg/L 6-BA配比组合的培养基胚性生长状况最好,胚性生长率最高(94.64%),更适宜作为胚离体培养的最佳激素浓度配比。

本研究表明,以B 5培养基+8%蔗糖+0.6%琼脂+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA为甘蓝型油菜胚离体培养最佳胚性生长体系,此条件下的离体幼胚维持胚性生长的状况最好,胚性生长率高,达94.64%。本研究建立了甘蓝型油菜胚性生长培养体系,为油菜胚性生长及种子含油量遗传机制研究提供了理论基础和技术支撑。