符丽梅,廖 欣,熊暮珺

(郴州市第一人民医院血液内科,郴州 423000)

获得性血友病A(acquired hemophilia A, AHA)是一种循环血中存在抗凝血因子Ⅷ(FⅧ)的自身抗体导致凝血功能障碍的自身免疫性疾病,该病的发病率较低,多见于老年人,其次为产后妇女,儿童群体罕见[1]。AHA无明显诱因,起病突然、病情凶险,可危及生命,其致命性出血的发生率约为9%～31%[2]。通过多年的调查分析及相关研究,目前已证明AHA的发病与多种基础疾病相关,包括自身免疫性疾病、妊娠、恶性肿瘤、药物等,但仍有至少50%的AHA患者无法确定基础疾病[3]。因此,探究AHA发生可能相关的因素是预防、诊断和治疗该疾病的重要手段。微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是一系列不具有蛋白编码功能的短链(18～22 bp)RNA分子,可稳定存在于包括血液在内的多种体液环境中。目前,在人类多种疾病中发现了差异表达的miRNAs,为疾病的诊断和治疗提供了新工具[4]。然而,尚未有研究针对AHA疾病发生和发展过程中的miRNAs进行挖掘和探究。

本研究收集了13例AHA患者的临床资料,旨在通过微列阵芯片技术和荧光定量PCR技术建立AHA患者血清中miRNA差异表达谱,筛选潜在功能miRNAs,从miRNAs水平为探究AHA病理机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究回顾性分析研究自2017年至2022年郴州市第一人民医院收治的13例AHA患者,患者平均年龄为(74.73±8.06)岁,男性5例,女性8例。患者纳入标准包括:①临床诊断、实验检测以及影像学信息符合AHA的诊断标准;②患者临床资料齐全;③无AHA家族遗传史;④入院前无AHA病史,无大出血或出血不止的病史;⑤临床病症包括皮肤瘀血斑、组织血肿、术后血流不止和凝血时间长等。纳入同期接受健康体检的志愿者13例作为健康对照(提供凝血检测结果),所有对照无AHA病史、家族遗传史,且凝血功能正常。AHA患者与健康对照在年龄和性别方面无显著差异(P>0.05)。所有参试者知情同意对临床样本和资料的分析,且本研究获得医院伦理委员会的批准(BZAST-2016KYKTPJ-18)。

1.2 实验室检查

检查指标包括AHA患者活化部分凝血活酶时间(APTT)、FⅧ的活性(FⅧ:C)和FⅧ抑制物滴度(FⅧ:Ab),具体方法如下。将全血与抗凝剂枸橼酸钠按照9∶1分离乏血小板血浆,使用APTT试剂、乏Ⅷ因子血浆、氯化钙试剂在Sysmex公司的CA-7000型全自动血液凝固仪检测患者APTT和FⅧ:C结果。

使用Bethesda法测定患者FⅧ:Ab,使用Bethesda单位(Bu)计量。能使血浆中的FⅧ:C降低50%的抑制物活性称为一个Bethesda单位。每毫升血浆中FⅧ:Ab的Bethesda单位数=受检血浆稀释度×Bethesda单位。

1.3 微列阵芯片分析筛选差异表达miRNAs

使用TRIzol试剂(北京百泰克生物,中国)提取3例AHA和3例健康对照血清样本中的总RNA,利用聚乙二醇沉淀法分离miRNAs。利用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计检测分离的miRNAs的纯度,观察A260/A280比值、计算RNA溶液浓度。使用微列阵芯片分析提取的miRNAs,首先将符合要求的miRNAs与杂交液于95 ℃孵育2 min,之后加入微列阵芯片装置,与探针于56 ℃孵育过夜,清洗芯片后使用LuxScan 10K-A双通道激光扫描仪扫描芯片,使用LuxScan 3.0和SAM 2.1软件对扫描结果和数据进行分析。分析结果基于表达差异倍数>2及P<0.05,筛选差异表达的miRNAs。

1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测样本中miRNAs表达量

使用TRIzol试剂提取剩余10例AHA和10例健康对照血清样本的总RNA。NanoDrop2000检测RNA纯度和浓度后,利用RevertAidFirstStrand cDNA synthesis Kit将收集的RNA反转录合成cDNA。使用SYBR Green PCR反应混合物以及7300实时PCR体系进行qPCR,以U6作为miRNA的反应内参,检测结果利用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。

1.5 统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析,正态分布的计量资料采用t检验或方差分析,非正态分布的计量资料采用秩和检验;计数资料采用卡方检验或秩和检验;采用Pearson相关系数分析潜在功能miRNAs与FⅧ:Ab的相关性。以上统计学分析中,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

AHA患者(n=13)和健康对照(n=13)的一般资料比较见表1,两组在年龄和性别方面的差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

表1 参试者一般临床资料比较

2.2 AHA患者血清中差异表达的miRNAs

分析芯片结果显示,与健康对照比较,AHA患者血清中存在23个差异miRNAs(见表2)。利用R绘制差异表达miRNAs的火山图(见图1),绘制miRNAs差异表达的热图(见图2),差异表达miRNAs包含了16个上调的miRNAs和7个下调的miRNAs。

红色点:显著高表达;绿色点:显著低表达

表2 AHA患者与健康对照血清中差异表达的miRNAs

2.3 miRNAs差异表达水平的验证结果

在10组参试者中验证芯片筛选出23个差异表达miRNAs,结果表明,与健康对照血清分析结果相比,AHA患者血清中miR-206、miR-144-5p、miR-374b-5p和miR-432-3p表达量显著上调(P<0.001),miR-92a-3p表达量显著下调(P<0.001,见图3)。

2.4 miRNAs与FⅧ:Ab的相关性分析结果

将筛选到的潜在功能miRNAs与AHA患者的FⅧ:Ab水平作相关性分析,用以初步探究miRNAs与AHA疾病进展的关联。相关性分析结果表明,miR-206(r=0.726,P=0.017)和miR-374b-5p(r=0.657,P=0.039)与FⅧ:Ab显著正相关,而miR-92a-3p则与FⅧ:Ab呈显著负相关(r=-0.730,P=0.015,见图4)。

2.5 miRNAs与AHA患者基础病的关联分析

鉴于AHA的发生与基础病密切相关,本研究进一步探究了miRNAs与患者基础病的关联。其中,10例AHA患者中有2例风湿性疾病、1例产后并发症、1例恶性肿瘤。分析结果表明,在患有基础病的AHA患者中,miR-206和miR-92a-3p的水平与无显著基础病的患者相比表现出明显的差异(P<0.05,见表3)。

表3 miRNAs与AHA患者基础病的关联

3 讨论

AHA属于罕见疾病,但其发病突然、病情进展迅速使得该疾病成为一种备受关注的凝血功能障碍疾病。该疾病主要是由于患者体内产生抗FⅧ的自身抗体,致使FⅧI:C降低,导致类似血友病A的出血症状,属于自身免疫性疾病[5]。目前,对于AHA的病因尚不明确,约占一半的患者伴有自身免疫性疾病、肿瘤、妊娠等基础疾病或条件,但另外至少一半的患者至今找不到明确的基础病。对于AHA疾病发生和发展相关病理机制的有限理解,严重限制了该疾病诊断和治疗手段的发展。因此,有必要探究AHA病理过程中的关键分子,从而为疾病的预防和治疗提供新思路。miRNAs是一系列不具有蛋白编码功能,但是可参与调控各类病理过程的关键调控因子[6]。人类多种疾病中均建立了miRNAs差异表达谱,从而促进了对疾病进展功能分子的探究和应用。基于改善和发展AHA预防和治疗方法的需求,本研究旨在利用微列阵芯片技术挖掘AHA潜在功能miRNAs。

在既往血友病的功能miRNAs研究中,一些表达差异的miRNAs被陆续报道。miR-5581-3p和miR-542-3p在血友病患者血清中表达水平显著上调,被证明是F8基因的上游靶向miRNAs,可通过靶向F8抑制FⅧ蛋白的合成,从而促进血友病的发生和发展[7]。2015年的一项研究建立了血友病患者的差异表达miRNAs谱,发现mIR-1246作为F8疾病的调控子参与血友病的病理进程[8]。以上研究均证明miRNAs在血友病的病理机制中发挥重要作用。然而,目前尚未有研究探究miRNAs与AHA的潜在关联。基于此,本研究建立了AHA血清差异表达miRNAs谱,并挖掘出23个差异表达miRNAs。并在进一步的验证实验中,基于10例AHA患者的血清样本,证明了这23个miRNAs中有4个miRNAs(miR-206、miR-144-5p、miR-374b-5p、miR-432-3p)在AHA患者血清中较健康对照显著高表达,另有1个miRNAs(miR-92a-3p)在AHA患者血清中低表达。

分析这5个差异表达miRNAs与FⅧ抑制物滴度FⅧ:Ab的相关性,发现miR-206和miR-374b-5p与FⅧ:Ab显著正相关,而miR-92a-3p与FⅧ:Ab呈显著负相关,说明这3个miRNAs可能参与AHA疾病的发生和发展过程。从AHA的病因来看,约一半患者存在基础病,本研究中的13例患者包括风湿性疾病3例、恶性肿瘤2例、产后并发症和术后大出血各1例。本研究比较了携带基础病的AHA患者与无明显基础病患者间miRNAs的差异,发现miR-206和miR-92a-3p水平表现出显著差异。miR-206具有调控免疫功能的潜能,在骨关节炎发病过程中具有调控Th17/Treg失衡的能力[9]。此外,miR-206在AHA发生的关键基础病恶性肿瘤中也发挥重要的作用。在非小细胞肺癌中,miR-206表达水平显著下调,具有抑制肿瘤发生和发展的抑癌作用[10]。在膀胱癌中,miR-206同样具有调控肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的功能[11]。对于miR-92a-3p,既往研究发现其在风湿类疾病中可通过干扰成纤维细胞样滑膜细胞的细胞功能参与疾病进展[12]。此外,在人类恶性肿瘤疾病中,miR-432-3p、miR-374b-5p和miR-144-5p均具有调控肿瘤进展的作用[13-15]。以上研究均说明筛选到的差异表达miRNAs具有一定水平的生物学调控功能,与AHA发生的基础病或许存在关系。

本研究的5个显著差异表达的miRNAs中,未能发现miR-144-5p、miR-432-3p与FⅧ:Ab的相关性,但由于分析仅在10例样本中开展,结果准确性可能受小样本量的限制。此外,虽然证明了2个miRNAs与基础疾病的关联,目前尚不明确miRNAs的差异表达是基础病因造成还是AHA发生直接导致。因此,未来的研究需要扩大样本量,从而验证和探究差异表达miRNAs的潜在功能。

综上所述,本研究基于AHA患者血清建立了miRNAs差异表达谱,并在10组AHA患者和健康对照血清中进行了验证和筛选,得到5个差异表达的miRNAs,为后续AHA功能分子的研究提供了素材和依据。此外,对于差异表达的miRNAs的研究,还可以参考患者基础病的情况,在进一步探究疾病病因关联的同时,揭示miRNAs与AHA疾病发生和发展的密切相关性。总之,研究结果将为AHA的预防、诊断和治疗提供新的分子候选物。