唐悦玲,李心怡

(1西安市中心医院整形外科,西安 710000;2安徽医科大学第一附属医院整形外科;*通讯作者,E-mail:lixinyi2023@163.com)

瘢痕疙瘩是一种常见的皮肤良性增殖性疾病,常伴有疼痛、瘙痒和过敏等症状,具有溃疡和感染的风险,同时也影响外观,严重侵害患者的身心健康[1]。目前,虽然对于瘢痕疙瘩的治疗具有多种手段,但是治疗效果一般,复发率极高[2,3]。因此,瘢痕疙瘩的治疗仍然是整形外科面临的重要难题。瘢痕疙瘩的发病过程与成纤维细胞的异常增殖和胶原过度沉积密切相关[4]。迄今为止,对于成纤维细胞在瘢痕疙瘩形成和浸润生长中的分子作用机制,尚不明确[5]。因此,鉴定对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成具有关键调控作用的基因,不仅可以加深对瘢痕疙瘩发病机制的理解,也可以为瘢痕疙瘩的治疗提供新的靶点。

沉默信息调节因子6(silent information regulator 6, SIRT6)组蛋白去乙酰化酶Sirtuins家族的一员,参与调控多种生物学功能,在代谢相关疾病、心脑血管疾病和肿瘤等多种疾病中发挥重要作用[6]。当前,已有研究报道发现SIRT6高度参与纤维化过程,其机制与调控转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号通路密切相关[7-9]。迄今为止,关于SIRT6是否参与调控瘢痕疙瘩的纤维化过程,尚未见研究报道。本研究将检测SIRT6在瘢痕疙瘩中的表达水平变化,并且探讨SIRT6对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成的调控作用及可能的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

细胞培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司;Trizol总RNA提取试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司;cDNA合成试剂盒PrimeScript RT reagent Kit和定量PCR试剂盒TB Green Fast qPCR Mix购自宝生物工程(大连)有限公司;蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和ECL发光试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;EdU试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人SIRT6抗体、GAPDH抗体、Col Ⅰ抗体和TGF-β1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司;兔抗人Smad2抗体、p-Smad2抗体、Smad3抗体和p-Smad3抗体购自赛信通(上海)生物试剂有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 SIRT6在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中的表达分析 瘢痕疙瘩和正常皮肤样本来自西安市中心医院整形科行瘢痕疙瘩切除术和美容/植皮手术的患者。为了检测SIRT6是否参与调控瘢痕疙瘩的形成,采用RT-qPCR和Western blot检测SIRT6在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中mRNA和蛋白表达水平变化。临床样本收集已获得患者或监护人的知情同意。实验研究在取得医院伦理委员会的批准后实施(XCH-2022016)。

1.2.2 成纤维细胞分离和培养 取新鲜瘢痕疙瘩切除组织放入无菌培养皿中,去除表皮和其他组织,采用无菌生理盐水多次冲洗。将组织块剪成1 mm3大小的小块,接种到无菌培养瓶中。将组织块贴壁放置,滴加胎牛血清,置于细胞培养箱中孵育5 h,待组织块完全贴壁后,加入2 ml含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的培养基,放入细胞培养箱中继续培养,每3 d更换一次培养基。待组织块周围爬满细胞时,倒掉培养基,PBS清洗2次。加入胰酶消化液,使细胞脱离培养瓶壁,加入2 ml含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的培养基,反复吹打。离心后,吸去上清液,重新加入含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的培养基。将细胞置于细胞培养箱,在37 ℃、5% CO2条件下,孵育培养。每2 d更换培养基一次,待细胞融合度到达80%以上,进行传代。取3～4代细胞,进行后续实验。

1.2.3 腺病毒感染和细胞分组 将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种到96孔板(3×103个/孔),按50的感染复数(multiply of infection,MOI)加入腺病毒,添加4 μg/ml Polybrene提高感染效率。把细胞放回培养箱孵育,24 h后更换为新鲜培养基,继续培养48 h。将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为空白对照组、Ad-NC组和Ad-SIRT6组。空白对照组细胞不进行任何处理,Ad-NC组细胞感染对照腺病毒,Ad-SIRT6组细胞感染SIRT6过表达腺病毒,继续培养72 h后,收集细胞进行后续实验检测。采用RT-qPCR和Western blot检测SIRT6的mRNA和蛋白表达水平,验证SIRT6过表达是否成功。采用EdU实验检测SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的调控作用。采用Transwell实验检测SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭的调控作用。采用Western blot检测Col Ⅰ蛋白表达的影响,评估SIRT6过表达对胶原合成的影响。采用Western blot检测TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3和Smad3蛋白表达水平的影响,评估SIRT6过表达对TGF-β1/Smad信号通路的影响。

1.2.4 RT-qPCR检测SIRT6的mRNA表达水平 采用Trizol试剂提取总RNA。取1 μg总RNA,加入逆转录酶溶液、缓冲液和反转录引物配,补加无RNase的水,配置成20 μl反应体系。逆转录反应条件设置为:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s。取2 μl逆转录反应产物,加入TB Green Fast qPCR Mix和正反扩增引物,补加无菌水,配置成25 μl反应体系。PCR反应条件设置为:95 ℃,30 min;95 ℃,5 s和60 ℃,10 s(40个循环)。以GADPH为内参基因,采用2-ΔΔCt公式计算SIRT6的mRNA相对表达水平。

1.2.5 Western blot检测SIRT6、Col Ⅰ、TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表达水平 采用蛋白提取试剂盒提取蛋白,按照BCA蛋白定量试剂盒方法测定蛋白浓度。配置浓缩胶和分离胶,按30 μg/孔将蛋白样品加入到浓缩胶中,进行电泳(80 V/30 min;120 V/60 min)。取分离胶,配制“三明治转模结构”,将蛋白从分离胶中转移到PVDF膜上。转模结束后,将PVDF膜侵入封闭液,室温封闭1 h。采用封闭液配置一抗稀释液(SIRT6抗体的稀释度为1∶1 000,Col Ⅰ抗体的稀释度为1∶5 000,TGF-β1抗体的稀释度为1∶1 000,p-Smad2抗体稀释度为1∶1 000,Smad2抗体稀释度为1∶1 000,p-Smad3抗体稀释度为1∶1 000,Smad3抗体稀释度为1∶1 000,GAPDH抗体的稀释度为1∶5 000),将膜浸入一抗稀释液中,4 ℃过夜孵育。次日,TBST洗膜,将膜与二抗稀释液孵育,室温1 h。TBST洗膜,将ECL试剂均匀涂抹到膜上,放入凝胶成像仪中,进行曝光和图像采集。

1.2.6 EdU实验检测SIRT6对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的调控作用 将瘢痕疙瘩成纤维细胞接种到含盖玻片的6孔培养板中。加入等体积的EdU工作液,使终浓度达到10 μmol/L。将培养板置于培养箱,继续孵育细胞2 h。去除培养液,加入4%的多聚甲醛,室温固定15 min。去除固定液,PBS洗涤细胞,加入含0.3% Triton X-100的PBS,室温孵育15 min。去除通透液,PBS洗涤细胞,加入EdU反应液,轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品,室温避光孵育30 min。去除反应液,PBS洗涤,加入DAPI溶液复染,室温避光孵育10 min。PBS洗涤,采用抗荧光淬灭封片液进行封片,随后在荧光显微镜下观察和采集图像。

1.2.7 Transwell实验检测SIRT6对瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭的调控作用 收集瘢痕疙瘩成纤维细胞,重悬在不含血清生长因子的培养基中,配置成5×104个/ml的细胞悬液。将200 μl细胞悬液添加到用基质胶铺好的Transwell上室中。向下室加入500 μl含20%胎牛血清的培养基。将Transwell装置放入细胞培养箱,24 h后取出小室,吸去上室多余液体,用棉棒轻轻转动,擦除残留细胞。加入4%多聚甲醛溶液固定30 min。PBS洗涤,加入结晶紫染液染色10 min。流水缓缓冲去染色液,风干后,置于显微镜下观察和采集图像。

2 结果

2.1 SIRT6在瘢痕疙瘩组织中的表达水平

与正常皮肤组织比较,瘢痕疙瘩组织中SIRT6的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01,见图1)。

与正常皮肤比较,**P<0.01

2.2 感染Ad-SIRT6对SIRT6表达水平的影响

与空白对照组比较,Ad-NC组中SIRT6的mRNA和蛋白表达水平无明显变化,而Ad-SIRT6组SIRT6的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01,见图2)。

与空白对照组和Ad-NC组比较,**P<0.01

2.3 SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

与空白对照组和Ad-NC组比较,Ad-SIRT6组瘢痕疙瘩成纤维细胞中EdU阳性细胞数量减少(P<0.01,见图3)。

图3 SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

2.4 SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭的影响

采用Transwell实验检测SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭的影响。与空白对照组和Ad-NC组比较,Ad-SIRT6组瘢痕疙瘩成纤维细胞的侵袭数量减少(P<0.01,见图4)。

与空白对照组和Ad-NC组比较,**P<0.01

2.5 SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响

采用Western blot检测SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞中Col Ⅰ表达的影响,评估胶原合成情况。与空白对照组和Ad-NC组比较,Ad-SIRT6组中Col Ⅰ的蛋白表达量减少(P<0.01,见图5)。

与空白对照组和Ad-NC组比较,**P<0.01

2.6 SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

与空白对照组和Ad-NC组相比,Ad-SIRT6组中TGF-β1蛋白表达量减少,p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比值降低,差异有统计学意义(P<0.01,见图6)。

与空白对照组和Ad-NC组比较,**P<0.01

3 讨论

SIRT6是一个多功能蛋白,对多种细胞生物学功能都有调控作用[10]。据报道,SIRT6可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭,从而发挥抑癌功能[11,12]。瘢痕疙瘩被认为是一种良性皮肤肿瘤,成纤维细胞具有肿瘤细胞的特征,其过度增殖、侵袭和胶原沉积是瘢痕疙瘩形成和浸润生长的重要基础。鉴于SIRT6具有对肿瘤细胞的抑制作用,本研究猜测SIRT6可能也具有调控瘢痕疙瘩的作用。为了验证这一假说,本研究首先检测了SIRT6在瘢痕疙瘩组织中的表达水平。与正常皮肤组织相比,SIRT6在瘢痕疙瘩组织中的表达水平显著降低,提示SIRT6的低表达可能与瘢痕疙瘩形成和进展密切相关。通过从瘢痕疙瘩分离培养成纤维细胞,本研究进一步探讨了SIRT6对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成的调控作用。研究结果发现,通过腺病毒介导的基因过表达技术在瘢痕疙瘩成纤维细胞中过表达SIRT6可有效抑制细胞增殖、侵袭和胶原合成。这些结果表明SIRT6对瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常活化,具有抑制作用。因此,靶向SIRT6开发新型瘢痕疙瘩治疗方法,具有一定的潜力和价值。

SIRT6对成纤维细胞的生物学功能具有重要的调控作用。SIRT6抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化,从而延缓老龄化相关的器官纤维化疾病发生和进展[7]。在血管外膜成纤维细胞中,SIRT6抑制血管紧张素Ⅱ诱导的细胞增殖、迁移和胶原产生[13,14]。另外,有文献报道,SIRT6可以抑制硬脑膜瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成,在椎板切除术引起的硬脑膜瘢痕的形成中发挥重要作用[15]。本研究进一步验证了SIRT6可调控成纤维细胞增殖、侵袭和胶原合成等生物学功能,拓展了SIRT6对瘢痕疙瘩成纤维细胞的调控作用。因此,SIRT6在纤维化相关的疾病包括瘢痕疙瘩的进展中扮演重要的角色。

TGF-β1/Smad信号通路是伤口愈合和组织修复不可或缺的调控机制,但是TGF-β1/Smad信号通路持续过度的激活会引起瘢痕疙瘩的形成[16]。据报道,TGF-β1在瘢痕疙瘩及其来源的成纤维细胞中表达水平显著升高[17],而TGF-β1/Smad信号通路的激活会促进成纤维细胞的增殖、侵袭和胶原蛋白的产生[18,19]。值得注意的是SIRT6是TGF-β1/Smad信号通路的重要负调控因子。在SIRT6敲除的小鼠中,TGF-β1和p-Smad3在各个器官组织中的表达水平显著增加[7]。在肝细胞中过表达SIRT6下调p-Smad3的蛋白水平,从而抑制肝纤维化的发生[20]。另外,SIRT6也下调p-Smad2的蛋白水平,从而阻断TGF-β1介导的纤维化过程[9,21]。因此,本研究检测了SIRT6过表达是否可以负向调控瘢痕疙瘩成纤维细胞中的TGF-β1/Smad信号通路。研究结果发现,过表达SIRT6显著下调瘢痕疙瘩成纤维细胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白水平。本研究结果和以往报道一致,证实了SIRT6对TGF-β1/Smad信号通路的负向调控作用。SIRT6在瘢痕疙瘩中低表达,可能是引起TGF-β1/Smad信号通路过度激活的一个重要因素。因此,通过过表达SIRT6阻断TGF-β1/Smad信号通路的激活,从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的过度增殖、侵袭和胶原沉积,可作为治疗瘢痕疙瘩的一种新策略。

综上所述,本研究发现在瘢痕疙瘩成纤维细胞中过表达SIRT6可以抑制细胞增殖、侵袭和胶原合成,其机制可能与下调TGF-β1/Smad信号通路有关。本研究推测SIRT6表达下调会导致TGF-β1/Smad信号通路负反馈调节机制的紊乱,促进成纤维细胞的过度增殖、侵袭和胶原沉积,从而引起瘢痕疙瘩的形成和进展。本研究为揭示瘢痕疙瘩形成的分子机制开辟了新的视野,为开发以SIRT6为靶点的新型瘢痕疙瘩治疗方法提供了一定的理论依据。但是,本研究存在一定的局限性。本研究主要检测了SIRT6过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用,并没有通过SIRT6敲低实验进行验证。因此,后续研究需要继续开展SIRT6敲低实验,通过正反功能实验的验证,才能更好地证实SIRT6在瘢痕疙瘩形成过程中的重要作用。