魏 晴,梁珊珊*

(1贵州中医药大学药学院中药炮制学教研室,贵阳 550025;2贵州中医药大学大果木姜子研究中心;3贵州中医药大学植物多糖研究中心;*通讯作者,E-mail:3113836821@qq.com)

胃溃疡(gastric ulcer,GU)是消化系统常见且多发的疾病。临床上以节律性和周期性上腹痛为特征,长期疼痛容易发展为慢性病[1,2]。研究表明,胃酸、胃蛋白酶、幽门螺杆菌、胃动力异常、遗传、环境、饮食、饮酒和压力等是攻击胃黏膜的主要因素[3,4]。现代人在饮食、饮酒、吸烟等方面的不良习惯会对胃黏膜及其屏障造成物理性或化学性损害,进而破坏黏膜屏障,引发胃溃疡。MicroRNAs(miRNAs/miRs)在免疫系统中发挥多种生物学功能。研究表明miR-146a可通过APLL1负向调控应激性溃疡的炎症反应,对胃溃疡有保护作用[5]。miR-146a过表达能够抑制肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6(TRAF6)和IL-1受体相关激酶1(IRAK1)等靶基因来调节炎症反应。TRAF6和IRAK1在NF-κB通路中作为信号转导器发挥作用,可以进一步激活IκB激酶以响应促炎细胞因子的表达[6,7]。

因此本研究以正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)为基础,通过无水乙醇诱导建立GU模型,研究miR-146a-5p是否参与到无水乙醇诱导的胃溃疡中,进一步寻找miR-146a-5p靶基因,探究miR-146a-5p和靶基因对无水乙醇刺激的胃黏膜上皮细胞的保护作用,以期为胃溃疡的预防和治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃黏膜上皮细胞GES-1购于武汉华联科生物技术有限公司,MTT试剂购自Biosharp生物技术有限公司,青-链霉素、0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液购自北京Solarbio科技有限公司,RMPI-1640培养液和胎牛血清购自美国Hyclone公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,蛋白裂解液购自北京Solarbio科技有限公司,IRAK1、NF-κB p65、IL-6和GAPDH一抗及相应二抗购自武汉三鹰生物有限公司,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒购自美国伯乐公司,miRNA反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司,转染试剂Lipofectamine®3000购自美国Sigma公司,TNF-α、IL-6和IL-10 ELISA检测试剂盒购自武汉华联科生物科技有限公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。高通量RT-qPCR仪(瑞士Roche公司),Western blot系统(美国伯乐公司),细胞培养箱(上海力申科学仪器公司),凝胶成像分析仪(美国伯乐生命医学产品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及胃溃疡模型的建立 人胃黏膜上皮细胞GES-1常规复苏后进行细胞培养,置于含10%胎牛血清的培养基中,在37 ℃、5% CO2的培养箱中常规培养。细胞分为空白组和模型组。空白组给予培养液常规培养。胃溃疡模型组是将对数生长期的细胞接种于6孔板培养24 h后,每毫升培养液中加入70 μl无水乙醇,培养8 h后,无水乙醇诱导的胃溃疡模型建立[8]。

1.2.2 MTT法检测细胞活性 为比较正常细胞和胃溃疡细胞活性,采用MTT法检测空白和模型组细胞活性。取GES-1细胞,以每孔3×104的细胞接种于96孔板中,并分为空白组和模型组(GU组)。在模型组细胞建立后,将两组细胞在37 ℃培养箱中分别培养24,48 h后,每孔再加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,继续培养4 h。4 h后吸尽培养液,每孔中加入150 μl DMSO,10 min后用酶标仪在490 nm测光密度(OD)值,测定细胞活性。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-146a-5p、IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA的表达 为比较正常细胞和胃溃疡细胞中相关基因表达,采用RT-qPCR检测空白组和模型组中miR-146a-5p、IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA的表达。miRNA试剂盒提取空白组和模型组细胞的总RNA,用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。按照反转录试剂盒反转录合成cDNA,以cDNA为模板,通过荧光定量试剂盒进行PCR扩增。PCR引物设计见表1。反应条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,进行35个循环,72 ℃再延伸5 min。

表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot检测细胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表达水平 将两组细胞接种于6孔板中,24 h后换液,采用无血清培养基培养。RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白,然后采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。随后各取10 μl样品进行SDS-PAGE,再将蛋白转移至膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入兔抗GAPDH(1∶20 000,10494-1-AP)、兔抗IRAK1(1∶1 500,10478-2-AP)、兔抗NF-κB p65(1∶1 000,10745-1-AP)、兔抗IL-6(1∶1 000,21865-1-AP)一抗,4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000,SA00001-2)室温孵育60 min,用ECL液显影,使用化学发光试剂盒在化学发光系统检测,结果采用Image-Pro Plus 6软件进行分析,计算蛋白表达水平。

1.2.5 ELISA法检测GES-1细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10水平 按照说明书,通过ELISA法检测空白和模型组细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 细胞转染 取对数生长期的GES-1细胞消化后,接种于6孔板内,培养24 h后按照Lipofectamine 3000试剂盒说明进行转染,分别标记为空白组(control)、GU组、mimic NC组、miR-146a-5p mimic组(转染miR-146a-5p mimic)、inhibitor NC组、miR-146a-5p inhibitor组(转染miR-146a-5p inhibitor)、siRNA NC组、siRNA IRAK1组(转染siRNA IRAK1),转染成功后,用于后续试验。

1.2.7 miR-146a-5p的靶基因预测 为进一步预测miR-146a-5p的靶点,采用预测软件Targetscan(http://www.targetscan.org)预测,物种选Human,依据context score评分,评分越低其靶基因可能性越大。

1.2.8 荧光素酶报告基因验证miR-146a-5p与IRAK1的靶向关系 依据Targetscan结果,IRAK1可能是miR-146a-5p的靶基因,为进一步确认二者关系,采用荧光素酶报告基因进行验证。预先构建了Psi-check 2/IRAK1-3′-UTR WT(野生型)和Psi-check 2/IRAK1-3′-UTR MUT(突变型)报告质粒。再通过Lipofectamine 3000使用miR-146a-5p mimic和miR-NC以及0.1 μg psi-check 2/IRAK1-3′-UTR WT或psi-check 2/IRAK1-3′-UTR MUT质粒瞬时共转染至GES-1细胞。分别建立miR-146a-5p mimic+IRAK1 3′ UTR-WT组、miR-146a-5p mimic+IRAK1 3′ UTR-MUT组、miR-NC+IRAK1 3′ UTR-WT组和miR-NC+IRAK1 3′ UTR-MUT组。采用多功能酶标仪检测两组细胞中萤火虫与海肾荧光比值,作为荧光素酶活性。进一步通过Western blot法比较miR-146a-5p mimic、miR-NC、miR-146a-5p inhibitor和inhibitor NC组中IRAK1蛋白的表达量,以确认miR-146a-5p和IRAK1调控关系。

1.2.9 过表达miR-146a-5p或敲减IRAK1后对胃溃疡细胞的影响 为进一步确认miR-146a-5p是否能够通过IRAK1调控胃溃疡的产生,采用过表达miR-146a-5p和敲减其相关靶点IRAK1蛋白,观察胃溃疡相关蛋白和炎症因子变化。取对数生长期的GES-1细胞消化后,接种于6孔板内,培养24 h后按照Lipofectamine 3000试剂盒说明进行转染,分别标记为空白组(control)、GU组、mimic NC组、miR-146a-5p mimic组(转染miR-146a-5p mimic)、siRNA NC组和siRNA IRAK1组(转染siRNA IRAK1),转染成功后,每毫升培养液中加入70 μl无水乙醇,培养8 h,建立无水乙醇诱导的胃溃疡模型。进一步通过Western blot检测GES-1细胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 无水乙醇刺激后对GES-1细胞的影响

MTT结果表明,在24 h和48 h时,与空白组相比,GU组细胞活性显著降低(P<0.01,见图1)。空白组GES-1细胞生长旺盛,呈长梭形均贴壁生长,有丝分裂细胞数较多;当用无水乙醇造模后GES-1细胞贴壁细胞数量减少,细胞变圆悬浮,部分细胞核浓缩(见图2)。

与空白组比较,**P<0.01

空白组 模型组

RT-qPCR结果表明,与空白组相比,GU组miR-146a-5p表达显著降低(P<0.01),IRAK1、NF-κBp65和IL-6 mRNA表达显著升高(P<0.01,见表2)。Western blot结果表明,与空白组相比,GU组IRAK1、NF-κB p65和IL-6表达显著升高(P<0.05或P<0.01,见图3)。ELISA结果表明,与空白组相比,GU组TNF-α和IL-6表达显著升高,IL-10表达显著降低(均P<0.01,见表3)。以上结果表明无水乙醇诱导的胃溃疡能够显著升高miR-146a-5p和相关蛋白以及炎症因子的表达。

与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01

表2 两组细胞中miR-146a-5p及IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA水平比较

表3 两组细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-10表达结果 (n=6,

2.2 miR-146a-5p与IRAK1靶向关系验证

靶基因在线软件Targetscan预测显示miR-146a-5p与IRAK1存在靶向关系,结合位点见图4A。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与IRAK1-WT+mimic NC组相比,IRAK1-WT+miR-146a-5p mimic组GES-1细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.01),而IRAK1-MUT+miR-146a-5p mimic组和IRAK1-MUT+mimic NC组GES-1细胞荧光素酶活性无明显变化(P>0.05,见图4B),说明miR-146a-5p与IRAK1存在靶向关系。与mimic NC组相比,miR-146a-5p mimic组IRAK1表达显著降低(P<0.01);与inhibitor NC组相比,miR-146a-5p inhibitor组IRAK1表达显著升高(P<0.01,见图5)。由以上结果进一步可知miR-146-5p可负向调控IRAK1蛋白的表达。

与mimic NC比较,**P<0.01

与mimic NC比较,**P<0.01;与inhibitor NC比较,##P<0.01

2.3 过表达miR-146a-5p对无水乙醇刺激的GES-1细胞的影响

与mimic NC组相比,miR-146a-5p mimic组GES-1细胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01,见图6)。进一步ELISA结果表明,与GU组或GU+mimic NC组相比,GU+miR-146a-5p-mimic组TNF-α和IL-6表达显著降低,IL-10表达显著升高(P<0.05,见表4)。以上结果表明miR-146a-5p参与到无水乙醇刺激的GES-1细胞的保护中,并能够减少炎症因子的释放。

与mimic NC组比较,*P<0.05,**P<0.01

表4 过表达miR-146a-5p对细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10表达的影响

2.4 敲减IRAK1对无水乙醇刺激的GES-1细胞的影响

Western blot结果表明,与siRNA NC组相比,siRNA IRAK1组IRAK1、NF-κB p65和IL-6表达显著降低(P<0.05或P<0.01,见图7)。

与siRNA NC组比较,**P<0.01

ELISA结果表明,与GU组或GU+siRNA NC组相比,GU+siRNA IRAK1组TNF-α和IL-6的表达显著降低,IL-10的表达显著升高(均P<0.05,见表5)。

表5 敲减IRAK1对细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10表达的影响

3 讨论

消化性溃疡是一种常见的消化系统疾病,包括胃溃疡和十二指肠溃疡,其中胃溃疡是最常见的一种,其主要临床表现为餐后上腹痛,伴有嗳气、反酸、烧心等症状,甚至出现胃穿孔和胃出血[9]。随着溃疡的反复发作,胃黏膜的损伤加重,最终导致癌变,胃癌的预后极差,甚至危及生命。研究表明,导致胃溃疡形成的因素很多,包括酗酒、不良生活习惯、生活压力过大、Hp感染、长期使用药物等[10]。因此,积极预防和治疗胃溃疡具有重要意义。

miRNA由内源基因编码,在多种生物学行为中发挥重要的调节作用,被认为广泛参与基因表达和RNA沉默的调控[11,12]。综合以前的文献和现代研究进展,本研究选择了与胃溃疡相关的miR-146a-5p进行进一步研究。尹斌[5]研究表明miR-146a可通过APLL1负向调控应激性溃疡的炎症反应,对胃溃疡有保护作用。过表达miR-146a后可降低NF-kB p65的蛋白和mRNA水平,同时还能够降低炎症因子TNF-α和IL-1β的表达[5]。本研究结果表明在无水乙醇诱导的GES-1细胞中miR-146a-5p的表达显著降低,伴随着各炎症因子含量也发生改变,而过表达miR-146a-5p后,各炎症因子含量逐步恢复,提示miR-146a-5p在胃溃疡发生及发展过程中可能发挥重要调控作用。

为进一步研究无水乙醇刺激的GES-1细胞中miR-146a-5p的作用机制,通过双荧光素酶结果发现,miR-146a-5p可与IRAK1靶向结合,且miR-146-5p可负向调控IRAK1蛋白的表达。作为一个丝氨酸-苏氨酸激酶,IRAK1可以介导Toll样受体(TLR)和白细胞介素-1(IL-1)信号通路,因此在先天免疫性疾病包括自身免疫性疾病、癌症、糖尿病或神经性疼痛中起着关键作用[13-16]。Li等[17]研究表明,在幽门螺旋杆菌所致胃溃疡中,过表达miR-146a能够抑制IRAK1和TRAF6表达水平,减轻胃黏膜损伤。Zhang等[18]研究表明,miR-146a缺陷的小鼠会出现严重的痛风性关节炎,通过TRAF6、IRAK1和NALP3引起炎症体失调。本研究进一步表明miR-146-5p可负向调控IRAK1蛋白的表达,并参与到炎症因子的释放中,保护胃黏膜。

IRAK1存在于NF-κB、IL-17等通路中,而研究表明NF-κB通路能够调节胃黏膜上皮细胞发生炎症反应[19]。进一步对下游通路研究表明,当IRAK1表达被抑制后,NF-κB p65和IL-6蛋白的表达降低,下游炎症因子TNF-α和IL-6的表达降低,IL-10的表达升高,提示miR-146a-5p靶向调控IRAK1后可以进一步抑制炎症相关反应。TNF-α、IL-6和IL-10是重要的炎症细胞因子,它们参与了炎症和胃溃疡的发展。TNF-α是一种由单核细胞和巨噬细胞分泌的内源性多向性炎症细胞因子[20,21]。TNF-α也是一种重要的炎症介质,会导致溃疡的形成。当炎症反应发生时,TNF-α会引起其他炎症因子的二次释放,如IL-2、IL-6、IL-10等,TNF-α还可激活中性粒细胞并释放氧自由基,产生急性期蛋白,阻碍胃黏膜的血液微循环,加重胃黏膜损伤[22]。本研究结果显示,与空白组相比,GU组细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量明显增加,而IL-10的含量则显著下降,说明胃溃疡造模后大量的炎症因子TNF-α和IL-6相继释放,IL-10的产生受到抑制,促进了炎症反应的发生。与GU组相比,GU+miR-146a-5p mimic或GU+siRNA IRAK1组,细胞上清液中IL-6和TNF-α的含量显著下降,IL-10的含量显著上升,表明miR-146a-5p可以通过抑制IRAK1的表达抑制炎症因子的释放,减少对胃肠道的损害,从而发挥对胃黏膜的保护作用。

综上所述,在无水乙醇刺激的GES-1细胞中,miR-146a-5p高表达能够起到保护胃黏膜的作用,其作用机制可能是通过miR-146a-5p靶向抑制IRAK1,进一步抑制炎症因子的释放,保护胃黏膜。本研究为miR-146a-5p靶向保护胃黏膜提供了新的思路和依据。