宋唯琦 唐秀平 邹云春 范浩博 王 英 谢 娟 胡秀珍

弱视是一种常见的儿童眼病,其在亚洲的发病率约为1.09%[1]。在儿童视觉发育关键期内存在皮层可塑性,但在关键期之后皮层可塑性下降,此时对弱视进行治疗十分棘手[2]。因此,如何激活皮层可塑性,提高弱视患者视觉功能是目前治疗弱视新的研究方向。重复经颅磁刺激(rTMS)是一项新的神经调控治疗技术。研究发现,高频重复经颅磁刺激(HF-rTMS) (>5 Hz)可引起长时程增强,对调节突触可塑性具有显著影响[3]。在初级视皮层应用HF-rTMS可短期内改善弱视眼的对比敏感度[4-5],而进一步增加刺激频率能长期改善弱视眼视功能[6-7]。脑源性神经营养因子(BDNF)是哺乳动物大脑中分布最广、表达丰富的神经营养因子;其在突触的正常生长、发育和可塑性中发挥重要作用[8]。既往研究发现,BDNF在弱视的发生发展中扮演重要的角色[9];并可通过激活下游通路抑制细胞发生凋亡[10]。本次我们就HF-rTMS对弱视大鼠视皮层BDNF表达及神经细胞凋亡的影响展开研究,以期为弱视的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选取3周龄清洁级SD大鼠30只,雌雄不限。 将大鼠置于(24±1)℃、相对湿度50%的饲养房内进行饲养,光暗交替各12 h。采用随机数字表法将大鼠分为3组:正常对照组(NC组)、单眼剥夺组(MD组)和单眼剥夺+HF-rTMS组(MD+HF-rTMS组),每组10只大鼠。NC组大鼠不给予任何干预;MD组和MD+HF-rTMS组缝合大鼠右眼眼睑3周建立弱视模型;MD+HF-rTMS组大鼠于造模成功后给予HF-rTMS刺激2周。本实验动物由川北医学院实验动物中心提供。本研究已通过川北医学院实验动物伦理委员会批准并全程接受其监督,动物处理遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。

1.2 方法

1.2.1 弱视动物模型的建立采用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.03 mL·kg-1)。NC组大鼠仅做麻醉处理;MD组和MD+HF-rTMS组大鼠在麻醉后采用眼睑缝合进行弱视造模。首先将右侧眼睑周围的毛发剪除,对眼睑局部皮肤进行碘伏消毒。将上、下眼睑的睑缘组织剪去0.5～1.5 mm,采用3-0丝线进行间断缝合。缝合完成后在缝合处涂抹左氧氟沙星眼膏。每天密切观察缝合部位,若出现角膜损伤或眼睑裂开则剔除实验。

1.2.2 图形视觉诱发电位的检测检测图形视觉诱发电位(PVEP)时,将三根动物电极针依次分别插入:记录电极插入双耳前缘连线枕部正中皮下,参考电极插入大鼠鼻骨皮下,接地电极插入大鼠尾部皮下。对记录电极、参考电极和接地电极之间进行电阻测量,要求阻抗小于 10 kΩ。PVEP采用棋盘翻转模式进行刺激,遮挡左眼,刺激距离为15 cm,刺激模式设定为每度0.04周,时间频率为1 Hz,对比度97%,采样时间300 ms,叠加100次;于暗室条件下进行检测。弱视模型建立成功的标准参考文献[11]。

1.2.3 HF-rTMS治疗方案将线圈中点对准大鼠枕骨顶点,与大鼠头皮相切;刺激频率为20 Hz,刺激10 s,间歇60 s;30%最大输出强度,一共5个序列;每天在相同时间进行刺激,连续14 d[12-13]。

1.2.4 Western blot法检测BDNF蛋白表达从-80 ℃冰箱中取出视皮层组织行组织蛋白提取。采用BCA法测定蛋白浓度,然后按照测定的浓度计算出各组视皮层30 μg上样量的体积。根据目标蛋白相对分子质量大小配置100 g·L-1的分离胶和浓缩胶,用SDS-PAGE 法进行电泳,之后转膜。50 g·L-1脱脂奶粉封闭2 h,4 ℃孵育BDNF抗体和GADPH抗体过夜,滴加二抗,最后进行显影。采用ImageJ图像处理软件对灰度值进行测量。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测BDNF mRNA表达从-80 ℃冰箱中取出视皮层组织放入EP管内,用 Trizol法提取总RNA,随后逆转录成cDNA。使用实时荧光定量PCR检测各组大鼠视皮层中BDNF mRNA的相对表达量。引物序列:BDNF正向为5’-CTTGGAGAAGGAAACCGCCT-3’,反向为5’-GTCCACACAAAGCTCTCGGA-3’;GAPDH正向为5’-TGAAGGTCGGAGTGAACGG-3’,反向为5’-TGAAGGTCGGAGTGAACGG-3’。收集目的基因与内参基因的Ct值,采用2-△△Ct计算出目的基因校正后的相对表达量。

1.2.6 各种染色及阳性细胞检测免疫组织化学染色、原位杂交染色和TUNEL染色均严格按照相应试剂盒说明进行。从每张视皮层切片中随机选取4个400倍视野进行图像采集,最后采用Image-pro plus6.0检测每高倍视野阳性细胞数与阳性细胞的平均光密度值。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示,三组间比较采用单因素方差分析,进一步的两两比较用LSD-t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠PVEP检测结果建模后,MD组和MD+HF-rTMS组大鼠相比, P100波振幅差异无统计学意义(P=0.69);MD组和MD+HF-rTMS组大鼠与NC组相比,P100波振幅下降,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS组和MD组大鼠相比, P100波振幅提高,差异有统计学意义(P<0.001);MD+HF-rTMS组大鼠 P100波振幅仍低于NC组,差异有统计学意义(P<0.001)(图1和表1)。

表1 各组大鼠建模后和HF-rTMS刺激2周后 P100波振幅

图1 各组大鼠HF-rTMS刺激2周后PVEP检测结果 A:MD组;B:MD+HF-rTMS组;C:NC组。

2.2 HF-rTMS刺激2周后各组大鼠视皮层BDNF蛋白及mRNA表达情况Western blot检测结果显示:HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS组大鼠视皮层BDNF蛋白相对表达量为0.74±0.03,高于MD组(0.61±0.02),但仍低于NC组(1.00±0.02),差异均有统计学意义(均为P<0.01)(图2)。实时荧光定量PCR检测结果显示: HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS组大鼠视皮层BDNF mRNA相对表达量为0.62±0.02,高于MD组(0.44±0.01),但仍低于NC组(1.00±0.05),差异均有统计学意义(均为P<0.01)。

图2 HF-rTMS刺激2周后各组大鼠视皮层BDNF蛋白表达情况

2.3 免疫组织化学染色结果HF-rTMS刺激2周后,各组大鼠视皮层中均有BDNF蛋白染色阳性细胞出现,BDNF蛋白表达位于细胞质中,阳性细胞被染成棕黄色或淡黄色。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS组BDNF蛋白染色阳性细胞平均光密度值及阳性细胞数(0.73±0.09,57.6±9.2)均高于MD组(0.43±0.09,28.9±6.0),低于NC组(1.06±0.08,86.7±7.8),差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图3)。

图3 HF-rTMS刺激2周后各组大鼠视皮层免疫组织化学、原位杂交和TUNEL染色结果(×400) 红色箭头示BDNF蛋白染色阳性细胞,蓝色箭头示BDNF mRNA染色阳性细胞,绿色箭头示凋亡染色阳性神经细胞。

2.4 原位杂交染色结果HF-rTMS刺激2周后,各组大鼠视皮层中均有BDNF mRNA染色阳性细胞出现,BDNF mRNA表达位于细胞质中,被染成棕黄色或淡黄色,与蓝染的细胞核重叠。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS组阳性细胞平均光密度值及阳性细胞数(0.94±0.15,62.3±4.5)均高于MD组(0.51±0.10,40.6±3.7),低于NC组(1.48±0.10,90.3±4.7),差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图3)。

2.5 TUNEL染色结果HF-rTMS刺激2周后,各组大鼠视皮层中均有凋亡染色阳性细胞出现,表达位于细胞核中,呈棕黄色或淡黄色,与蓝染的细胞核重叠。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS组凋亡染色阳性神经细胞数(54.6±8.6)低于MD组(84.8±6.3),高于NC组(23.9±5.9),差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图3)。

3 讨论

弱视是一种常见的儿童眼病,可导致视路之间信号转导障碍,临床主要表现为矫正视力低下。PVEP是视功能检查的客观手段[14],可反映从视网膜到视皮层之间的视觉传导功能。在本研究中,我们对3周龄大鼠进行3周的眼睑缝合后,剥夺眼P100波振幅下降,提示3周的形觉剥夺可造成弱视。经HF-rTMS治疗2周后,MD+HF-rTMS组大鼠P100波振幅高于MD组,提示HF-rTMS可改善弱视大鼠视觉功能。

BDNF作为一种重要的神经递质,通过与特异性受体结合,激活下游通路,对大脑的发育,神经元的生长、分化,以及对突触可塑性的调节发挥重要作用[8]。研究表明,BDNF对弱视的发生与发展具有重要意义,弱视发生时个体BDNF表达下降[15],通过鼻腔注射BDNF可长期改善弱视大鼠的视觉功能[9]。本研究发现,MD组大鼠视皮层BDNF蛋白及mRNA表达明显低于NC组,这与既往研究结果一致。近年来,大量研究发现,HF-rTMS治疗可提高实验动物海马及皮层中BDNF的表达。Shang等[16]研究发现,HF-rTMS治疗可提高正常大鼠的认知功能和海马区BDNF的表达;Ma等[17]通过对衰老的昆明小鼠进行HF-rTMS治疗发现,其改善了老年小鼠的认知缺陷,提高了海马区BDNF的表达。长期失重可造成小鼠的学习和记忆缺陷,Zhai等[18]研究发现,通过HF-rTMS治疗长期失重可使受试对象记忆受损减轻,海马区BDNF表达升高。Zhang等[19]通过对血管性痴呆大鼠模型进行HF-rTMS治疗发现,血管性痴呆大鼠的学习和记忆能力提高,海马区BDNF的表达水平上升。而对于更严重的大脑中动脉堵塞大鼠模型,Cui等[20]通过有氧运动联合HF-rTMS进行治疗发现,大鼠运动诱发电位提高、梗死面积减少、皮质中BDNF的表达明显增加。本研究发现,HF-rTMS治疗后,大鼠视皮层BDNF蛋白及mRNA表达增加,提示HF-rTMS改善弱视大鼠视功能的作用机制和提高BDNF表达有关。

凋亡是一种程序性死亡,通常发生在细胞发育和衰老过程中。而弱视属于神经发育障碍性疾病。研究发现,弱视的发生可导致视皮层凋亡神经细胞数明显增加[21],本研究发现,MD组大鼠视皮层凋亡神经细胞数明显多于NC组,与既往研究结果一致。既往研究发现,HF-rTMS治疗具有抗凋亡作用,Yoon等[22]对缺血模型大鼠进行HF-rTMS治疗发现,缺血区域Bcl2蛋白表达升高,促凋亡蛋白Bax表达下降。Guo等[23]对大脑中动脉阻塞模型进行HF-rTMS治疗发现,模型动物海马区Bcl2蛋白表达升高,Bax蛋白表达以及凋亡阳性神经细胞数降低。Yan等[24]对抑郁大鼠模型进行HF-rTMS治疗发现,海马区Bcl2蛋白表达升高,Bax蛋白表达以及凋亡阳性神经细胞数降低。本研究发现,MD+HF-rTMS组大鼠视皮层凋亡神经细胞数明显低于MD组,提示HF-rTMS可改善弱视大鼠视皮层神经细胞凋亡情况。

此外, 有学者发现,BDNF可通过拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受体的兴奋性毒性作用,促进树突状细胞再生而发挥神经保护作用,并通过调节Bcl2蛋白和/或通过Bad和Bim等凋亡相关蛋白的翻译后修饰而发挥抗凋亡作用[10]。本研究结果显示,HF-rTMS治疗后大鼠视皮层BDNF表达升高,神经细胞凋亡数降低,推测HF-rTMS的作用机制可能是通过提高BDNF的表达,激活下游抗凋亡通路,进而减少视皮层神经细胞凋亡,最终参与神经重塑过程。