翁邦碧，李玉良，罗 丹，枉 前△

（1. 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，重庆 400038； 2. 中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，云南 昆明 650032）

鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii（AB）为非发酵革兰阴性杆菌，是引起呼吸道感染的主要条件致病菌。随着侵入性治疗措施的频繁操作、抗菌药物的大量和不合理使用，引起多耐药、泛耐药、全耐药AB 不断涌现，导致临床可用治疗药物和策略十分有限［1］。虽然临床是根据抗菌药物敏感性试验（简称药敏试验）最低抑菌浓度（MIC）选择合适的药物和治疗路径，但其临床治疗结果与预期仍有差距，重要原因为AB 感染后可进入细胞内，形成胞内菌感染［2-3］，是造成感染迁延不愈、感染复发的重要原因［4-5］。细菌一旦进入细胞内部，一部分可因抗原暴露导致细胞自噬而重新暴露于抗菌药物环境被杀灭，另一部分则可通过改变自身蛋白或调节代谢强度而长期生存于胞内，可躲避抗菌药物的接触及免疫细胞的捕获，在细胞内长期生存，在宿主免疫力低下时可能会引发慢性感染或感染复发［6］。AB通常被认为是专性胞外细菌，可不同程度地进入细胞内［7-9］，但尚未明确抗菌药物对AB入侵细胞内数量的影响。目前，多采用庆大霉素保护实验（GPA）的平板计数法检测细胞内细菌［10-11］，但该方法存在耗时、工作量大、重复性差的缺点；实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）也常被用于胞内细菌检测［12］，但难以消除被药物杀灭的胞外死菌对检测的干扰。课题组前期采用月桂酰基肌氨酸钠（SLS）/改良叠氮溴化丙锭（PMAxx）去除非活性细菌基因组干扰，构建了1种活菌核酸微定量技术（PMAxx-qPCR），成功运用于AB 快速表型药物敏感性的测定［13］。本研究中将该技术应用于胞内活菌数量的检测，以评价抗菌药物对胞内AB感染数量的影响，以及细胞参与时抗菌药物对AB药物敏感性的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与菌株

仪器：Sorvall ST 16R 型冷冻高速离心机，481 型全温摇床，B6120 型微生物培养箱，3111 型二氧化碳培养箱，均购自美国Thermo Fisher公司；SW-CJ-2FD型超净台（江苏苏净集团有限公司）；PMA-Lite LED 光解仪（美国Biotium 公司）；CFX - 96 型荧光定量PCR（美国BIO - RAD 公司）；OSE - DB - 01 型五段程控金属浴（北京天根生化科技有限公司）；LDZX-50KBS 型高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；CKX53 型倒置显微镜（日本Olympus公司）。

试药：营养琼脂平板（重庆庞通医疗器械有限公司，批号为22J2404）；卢里亚-贝尔塔尼（LB）培养基（北京索莱宝科技有限公司，批号为318Q031）；SLS（批号为F321BA0023），引物（批号为9015629），均购自上海生工生物工程股份有限公司；PMAxx（美国Biotium公司，升级版，批号为19P0725）；QuantiNova SYBR Green PCR Kit（批号为169017812），细菌基因组DNA 提取试剂盒（批号为163043064），均购自德国Qiagen 公司；RPMI 1640培养基（美国HyClone 公司，批号为AH29755233）；胎牛血清（德国PAN - Biotech 公司，批号为P140109）；0.25%Trypsin（苏州新赛美生物科技有限公司，批号为20230105）；磷酸盐缓冲液（PBS，武汉普诺赛生命科技有限公司，批号为WH0023N171）；罗丹明鬼笔环肽（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号为96201203004）；Triton X - 100（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批号为DH351-464L00150）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技术有限公司，批号为03052120706）；抗菌药物（中国食品药品检定研究院）。

菌株：AB标准菌株ATCC 17978、aba 242，人支气管上皮（HBE）细胞由本院临床试验机构提供；绿色荧光蛋白融合AB（AB-GFP）以基因组重组技术构建，可稳定表达绿色荧光蛋白，由陆军军医大学药学与检验系邹全明教授课题组惠赠。

1.2 方法

1.2.1 AB 特异性诊断基因（blaOXA-51）检测

针对blaOXA-51基因设计合成引物和探针，并进行局部序列排比检索（BLAST）验证。正向引物为5' -GGTAATGATCTTGCTCGTGCTT - 3'，反向引物为5' -TGTGGTGGTTGCCTTATGGT - 3'［2］。采用试剂盒方法提取细菌基因组DNA，随后进行qPCR 检测。反应条件为95 ℃预变性2 min（95 ℃5 s →60 ℃10 s），40 个循环，溶解曲线65 ℃5 s →95 ℃，收集SYBR 荧光信号。qPCR软件自动计算荧光阈值（Ct）。

1.2.2 细胞外活菌检测

参照课题组前期已建立的细胞外活菌检测方法［2］，取700 μL 基因组样本，12 000g离心5 min，弃上清液655 μL，加PMAxx 5 μL，涡旋15 s，瞬时离心，置暗处孵育5 min，使PMAxx 充分渗入死菌细胞，再置光解仪中光照5 min，按QIAamp DNA Mini Kit 说明书提取细菌基因组。以上述细菌基因组为模板，加入2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正/反向引物各0.8 μL、无酶水6.4 μL、模板2 μL，对AB 特异性鉴别基因blaOXA-51进行扩增。

1.2.3 标准曲线建立

取对数生长期的ATCC 17978，麦氏比浊至0.5 麦氏，10 倍比稀释7 个浓度，得到包括原液在内的8 个溶液。按细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组，进行qPCR 检测。采用平板稀释法测定菌液原始浓度，以log（cfu/mL）为横坐标（X）、荧光Ct值为纵坐标（Y），以最小二乘法绘制标准曲线。

1.2.4 HBE 细胞培养及细菌感染细胞模型建立

以90% RPMI 1640 培养基及10%胎牛血清为完全培养基，在细胞传代3 次后，将细胞收集于15 mL 离心管中，对细胞悬液进行计数，以完全培养基稀释至1 ×105个/mL，加500 μL 至24 孔培养板，置细胞培养箱孵育。待细胞生长至约90%密度时，弃上清液，PBS洗涤细胞2 次，加RPMI 1640 培养基500 μL，适应性培养1 h，加5 × 107cfu/ mL 菌液共同培养，感染复数（MOI）约为100。

1.2.5 侵袭时间及MOI 考察

侵袭时间：细胞适应性培养1 h后，加5×107cfu/mL ATCC 17978 菌液500 μL，分别与HBE 细胞共同培养2，4，6，8 h。

MOI：细胞适应性培养1 h后，分别加入5×106cfu/mL、1 × 107cfu/ mL、2.5 × 107cfu/ mL、5 × 107cfu/ mL ATCC 17978菌液500 μL，与HBE细胞共同培养6 h。

弃上清液，每孔加1 mL PBS 洗涤3 次，再加500 μL含庆大霉素（质量浓度为1 mg/mL）的RPMI 1640 培养基，继续孵育1 h，以去除细胞外细菌。PBS 以1 mL 每孔再次洗涤细胞3 遍，以去除上清液中的庆大霉素。加200 μL 0.25%Trypsin-0.4%TritonX-100裂解液（1∶1，V/V），充分裂解细胞后取100 μL 均匀涂布于营养琼脂平板，24 h后计数。

1.2.6 胞内菌定量检测方法的检测结果比较

加细胞裂解液，待细胞内细菌释放后，分别以平板计数法、qPCR 法、PMAxx - qPCR 法进行胞内ATCC 17978细菌检测，并比较结果。

平板计数法：取100 μL 细胞裂解液，均匀涂布于营养琼脂平板，24 h后计数。

qPCR 法：参照QIAamp DNA Mini Kit 说明书提取细胞内细菌基因组。以上述细菌基因组为模板，加2 ×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正/ 反向引物各0.8 μL、无酶水6.4 μL、模板2 μL，对AB 特异性鉴别基因blaOXA-51进行扩增。

PMA-qPCR 法：加细胞裂解液，待胞内菌释放后，同1.2.2项下方法操作。

1.2.7 不同抗菌药物对胞内菌感染的影响

细胞适应性培养1 h 后，弃上清液，加含药RPMI 1640 及ATCC 17978 菌液，轻晃摇匀，使细菌与细胞充分接触，共同置细胞培养箱孵育。弃上清液，每孔加1 mL PBS 洗涤3 次，再加500 μL 含庆大霉素（质量浓度为1 mg/ mL）的RPMI 1640 培养基，继续于细胞培养箱孵育1 h，以去除细胞外细菌。PBS 以1 mL 每孔再次洗涤细胞3 遍，以去除上清液中的庆大霉素。取100 μL 0.25% Trypsin 处理细胞2 min，加完全培养基100 μL、RPMI 1640 培养基300 μL，充分混匀后转移至1.5 mL EP 管，离心（转速为12 000 r/ min）5 min，取180 μL 按细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组，进行qPCR检测，计算胞内细菌浓度。

1.2.8 0.1 倍MIC庆大霉素对AB 侵袭HBE 细胞的影响

操作同1.2.7项下至“去除上清液中的庆大霉素”。加4%多聚甲醛1 mL 室温固定细胞15 min，PBS 漂洗3 遍，每次3 min，加0.1% TritonX - 100 1 mL 处理细胞5 min，PBS 漂洗3 遍，每次3 min；加200 μL 5 μg/mL 罗丹明鬼笔环肽避光染细胞骨架30 min，PBS漂洗3遍，每次3 min；加200 μL 5 μg/mL DAPI避光染细胞核5 min，PBS漂洗3 遍，每次3 min；以800 μL PBS 浸润细胞，激光共聚焦显微镜下观察结果。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism 8.3 软件进行统计与作图。计量资料以±s表示，两组比较采用t检验，3组及以上比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线

按1.2.3 项下方法进行线性回归，得回归方程Y= - 3.235 1X+ 42.076（R2= 0.994 3，n= 6）。结果ATCC 17978浓度在2～7 log（cfu/mL）范围内与Ct值线性关系良好，提示Ct值可较准确地反映细菌数量。

2.2 HBE 细胞培养及细菌感染细胞模型

结果显示，空白HBE 细胞在24 h 内正常生长，ATCC 17978及aba 242感染的HBE细胞在8 h起出现固缩、脱落、坏死，随着感染时间的延长，细胞脱落及坏死逐渐增加，表明已成功建立AB 的细胞感染模型。详见图1。

注：绿色箭头为脱落细胞，黄色箭头为固缩细胞，红色箭头为成片死亡细胞；Control为不加菌液的HBE细胞正常生长对照，Ab为ATCC 17978标准株，aba242为临床分离AB菌株。图1 鲍曼不动杆菌对HBE细胞的侵袭作用（×200）Note：The green arrow refers to detached cells，the yellow arrow refers to pyknotic cells，and the red arrow refers to patches of dead cells.Control is the normal growth control of HBE cells without bacterial solution，Ab refers to the ATCC 17978 standard strain，and aba242 refers to the clinically isolated AB strain.Fig.1 Microscopic view of the invasion of Acinetobacter baumannii to HBE（×200）

2.3 侵袭时间及MOI

侵袭时间：ATCC 17978 入胞量呈时间依赖性，8 h时达到本次实验最大值（图2 A），但8 h 时感染细胞已开始逐渐出现固缩、脱落现象（图1），故选取6 h 为实验所需时间。

A. 侵袭时间 B.MOI注：ns为P ＞0.05；组间比较，*P ＜0.01，**P ＜0.001。图3同。图2 鲍曼不动杆菌对HBE细胞的侵袭时间及MOI考察A.Invasion time B.MOINote：ns refers to P ＞0.05；* refers to P ＜0.01，and ** refers to P ＜0.001 among different groups（for Fig.2-3）.Fig.2 Invasion time and MOI of Acinetobacter baumannii to HBE cells

MOI：在MOI为10～50 范围时，ATCC 17978 侵袭量无显著变化；当MOI升至100 时，ATCC 17978 侵袭量显著增加，故选取MOI为100进行实验。详见图2 B。

2.4 胞内菌定量检测方法的检测结果比较

由表1可知，PMAxx-qPCR法与平板计数法所测结果接近，但前者耗时更短（＜2 h，平板计数法为18～24 h）；传统qPCR法与PMAxx-qPCR法检测时效相当（＜2 h），但传统qPCR 法所测结果较另外2 种方法均偏高，提示传统qPCR 法无法排除死菌及胞外黏附菌对检测结果的干扰，而PMAxx-qPCR 法则兼具平板计数法的准确性及传统qPCR法的时效性，可用于细胞内AB检测。

表1 3种方法的胞内鲍曼不动杆菌定量检测结果（±s）Tab.1 Quantitative detection results of intracellular bacteria obtained by three different methods（±s）

表1 3种方法的胞内鲍曼不动杆菌定量检测结果（±s）Tab.1 Quantitative detection results of intracellular bacteria obtained by three different methods（±s）

MOI _______________________________________________________________log（cfu/mL）/Ct值200 100___20_____________________________平板计数法2.27±0.51 2.22±0.62 1.78±0.15___qPCR法______________5.36±0.02/23.31±0.06 5.15±0.02/23.98±0.05 4.31±0.08/26.78±0.26___PMAxx-qPCR法_____2.69±0.14/32.14±0.48 2.63±0.15/32.34±0.48 2.35±0.04/33.28±0.14_

2.5 不同抗菌药物对胞内AB 感染的影响

由图3 可知，0.1 倍、1 倍、10 倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素，以及1 倍、10 倍MIC的多西环素、庆大霉素，均能抑制ATCC 17978侵袭HBE 细胞形成胞内AB；阿奇霉素、左氧氟沙星、多西环素对胞内AB 的形成可能具有剂量依赖性的抑制作用；0.1 倍MIC的庆大霉素对胞内AB 的形成可能具有促进作用；0.1 倍、1 倍、10 倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素、多西环素、庆大霉素，均不能有效杀灭胞内ATCC 17978。

注：AZM为阿奇霉素，LEV为左氧氟沙星，DOX为多西环素，SCF为头孢哌酮舒巴坦，GEN为庆大霉素，TGC为替加环素。图3 不同种类及不同浓度抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响Note：AZM is azithromycin，LEV is levofloxacin，DOX is doxycycline，SCF is cefoperazoneandsulbactam，GEN is gentamicin，and TGC is tigecycline.Fig.3 Effect of different types and concentrations of antibiotics on the intracellular infection of Acinetobacter baumannii

2.6 0.1 倍MIC 庆大霉素对AB 侵袭HBE 细胞的影响

由图4 可知，在0.1 倍MIC的庆大霉素作用下，AB-GFP侵袭进入HBE细胞的量显著增加，与PMAxxqPCR 法测定胞内ATCC 17978 的结果一致，表明0.1 倍MIC庆大霉素对AB侵袭HBE细胞具有促进作用。

A.HBE细胞 B.HBE细胞+AB-GFP C.HBE细胞+AB-GFP+GEN图4 0.1倍MIC 庆大霉素对鲍曼不动杆菌侵袭HBE细胞的影响A.HBE cells B.HBE cells+AB-GFP C.HBE cells+AB-GFP+GENFig.4 Effect of 0.1 times MIC gentamicin on the invasion of Acinetobacter baumannii to HBE cells

3 讨论

AB 通常被认为是专性胞外细菌，常以黏附的方式定植于宿主，对细胞的侵袭力较弱［7］。有研究显示，随着AB耐药株分离率的逐年升高，AB的临床分离株显示出比ATCC 17978 更高的细胞侵袭毒力，并具有在上皮细胞内繁殖的能力［8-9］。基于此，本研究中纳入了临床常用不同种类的抗菌药物，并考察了高、中、低浓度（10倍、1倍、0.1倍MIC）作用下，抗菌药物对AB侵袭入胞的影响。研究发现，在有宿主细胞参与时，中、高浓度（1 倍、10 倍MIC）的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素、多西环素、庆大霉素均不能有效杀灭胞内AB，提示体外药敏试验可能不能完全反映有宿主参与时细菌对药物的敏感性，可能是感染治疗失败及感染复发的重要原因。LIU 等［2］以上皮细胞为模型，发现不同细菌及不同药物在细胞内外的最低杀菌浓度具有异质性，A549 及HepG2 上皮细胞内外的最低杀菌浓度可相差高达800 倍。LEHAR 等［3］则以巨噬细胞为模型，测试了万古霉素、达托霉素、利奈唑胺、利福平环境下耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在巨噬细胞内外的MIC，显示胞内外MIC相差100～12 500 倍［3］。结合本研究结果及文献报道，提示经典的体外MIC 试验可能并不能准确反映抗菌药物在体内的治疗效果，需建立更接近体内环境的药物敏感性检测方法，以指导临床合理选择抗菌药物。

体外细胞感染模型是用于评价抗菌药物体内治疗效果的常见选择［14］，细胞的参与使其较传统药敏试验更接近体内环境，但细胞不可避免地会被细菌“劫持”并进入细胞，进入细胞内的细菌通常存在于细胞的空泡中，以此躲避抗菌药物的接触及细胞自噬激活。故建立有细胞参与的MIC 测定方法需首先解决细胞内细菌的定量问题。本研究中建立了检测胞内AB 活菌的PMAxx-qPCR 法，可有效缩短检测时长，并具有操作简便、结果准确、不受死菌干扰的优点，可为建立有宿主参与的药物敏感性评价方法奠定基础。

本研究中主要纳入临床抗呼吸道感染常用抗菌药物，尽管阿奇霉素并不作为常规抗AB 药物使用，但其常用于囊性纤维化、支原体肺炎或经验性抗感染治疗。本研究结果提示，阿奇霉素在体外具有抑制胞内AB 生长的作用，即使浓度降至0.1 倍MIC，仍可显著抑制胞内AB 的生长。这可能得益于阿奇霉素良好的组织及细胞穿透性，具有较高的组织及细胞内药物浓度［15-16］。且阿奇霉素为抑菌剂，可抑制非繁殖期细菌的生长，使入胞后的细菌处于低复制水平［9］。

使用抗菌药物治疗感染性疾病时，患者不可避免会处于0.1 倍MIC阶段［17-18］，而部分0.1 倍MIC抗菌药物可通过增强细菌毒力因子的产生来促进不同细菌的入胞及在细胞内的持留［2］。本研究中发现，0.1倍MIC庆大霉素可能会促进胞内AB 的形成，提示在临床治疗细菌感染时应注意足剂量、足疗程使用庆大霉素，尽量缩短患者处于亚抑菌浓度的时间。