石佳琦,梁国栋,王 娜,韩运祺,王玥璇,朱秋梦,吕 玮,张 昕,肖云峰

(1.内蒙古医科大学药学院,内蒙古 呼和浩特 010110; 2.内蒙古大唐药业股份有限公司,内蒙古自治区蒙药新药研发企业重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010010; 3.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心/内蒙古医科大学药学院,内蒙古 呼和浩特 010110)

沙棘作为药食同源植物,具有很高的营养成分和药用价值[1-2]。沙棘糖浆是根据蒙古医书《饮膳正要》中赤哈纳(即沙棘)的方剂,以《蒙药正典》中的“沙棘祛痰,融化血,治巴达干病”为依据[3],将沙棘果实压榨成汁,经提取、过滤、浓缩等一系列工艺后,再加入蔗糖浆进行稀释,制成以沙棘汁为原料的糖浆剂。具有止咳化痰、消食化滞等作用。有文献表明,沙棘糖浆可抑制小儿呼吸道感染,缓解咳嗽,改善儿童功能型消化不良,疗效显著[4-5]。本研究根据沙棘糖浆的功能主治,采用幼龄实验动物为研究对象,进行了止咳祛痰、消食化滞方面的药效学实验研究,为其临床应用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SD大鼠,SPF 级,体质量(95±10)g;KM小鼠,SPF 级,体质量(15±2)g;英国(Hartley)豚鼠,SPF级,体质量(200±10)g。SD大鼠、KM小鼠购自斯贝福生物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2019-0010。英国(Hartley)豚鼠由北京市昌扬西山养殖场提供,动物生产许可证号:SCXK(京)2021-0008。饲养于内蒙古医科大学动物实验中心洁净区。动物使用许可证编号:SYXK(蒙)2020-0001。

1.2 药物与部分试剂

沙棘糖浆(内蒙古大唐,批号20825018)。小儿止咳糖浆(华润三九,批号2001031N);四磨汤口服液(湖南汉森,批号2004311)。柠檬酸(优晟环保,批号20200706);乌拉坦(上海康拓,批号20201110);碳酸氢钠(海兴旭阳,批号20191008);酚酞(沈阳金天源,批号20201116);中筋面粉(枣庄市内丰,批号20210326);现磨熟黄豆粉(哈尔滨宝利,批号20210423);大崎鱼松粉(东山县海弘,批号20210526);Mouse GAS、MTL、Pepsin、Trypsin、α-amylase Elisa kit(泉州市睿信,批号20210522001);高纯食用葡萄糖粉剂(广西梧州,批号20210502);淀粉(菱花集团,批号20200724);食用级活性炭末(钰洋家具专营店,批号20200423)。

1.3 仪器

压缩式雾化器(尚钧医疗科技有限公司,型号 NB60);全自动酶标仪(美国Thermo Fisher,型号Multiskan MK3)。

1.4 主要试剂的配制

1.4.1 高热量高蛋白饲料

将大崎鱼松粉、现磨熟黄豆粉、中筋面粉、全脂高钙奶粉按 1∶2∶1∶1 的比例混合,做成长条状,阴干即得。

1.4.2 营养性半固体糊

取全脂高钙奶粉18g、高纯食用葡萄糖粉8g、淀粉8g和食用级活性炭末2g,称定,置500mL烧杯中,加1%羧甲基纤维素钠300mL搅拌均匀,即得。

1.5 沙棘糖浆对幼龄实验动物止咳化痰的作用

1.5.1 沙棘糖浆对幼龄豚鼠止咳效果的影响

取120只豚鼠,采用枸橼酸引咳法[6],将咳嗽次数n<5次和n>50次及潜伏期T<10 s和T>360 s的豚鼠剔除。次日将筛选出的合格的100只豚鼠,♀♂各半,随机分为模型组、止咳糖浆组、沙棘糖浆低[1.45 g/kg(1.62 mL/kg)]、中[2.91 g/kg(3.23 mL/kg)]、高[5.82 g/kg(6.47 mL/kg)]剂量组5组。止咳糖浆组灌胃给予止咳糖浆5.6 mL/kg,空白组灌胃等体积饮用水,1次/d,给药14 d。于末次给药前禁食不禁水约8 h,末次给药1 h后按预实验方法进行试验并记录咳嗽潜伏期和5 min内咳嗽次数。

1.5.2 沙棘糖浆对幼龄大鼠痰液排放量的影响

取100只SD大鼠,♀♂各半,随机分为模型组、止咳糖浆组、沙棘糖浆低[1.70 g/kg(1.89 mL/kg)]、中[3.40 g/kg(3.78 mL/kg)]、高[6.81 g/kg(7.56 mL/kg)]剂量组5组。灌胃给药,止咳糖浆组灌胃给予止咳糖浆3.83 mL/kg,空白组灌胃等体积饮用水,1次/d,给药14 d。参考文献[7]进行实验。

1.5.3 沙棘糖浆对幼龄小鼠气管酚红排泌量的影响

取KM小鼠120只,用氨水引咳法对小鼠进行筛选,选用3 min内发生咳嗽的小鼠作为实验小鼠。选取合格小鼠100只,♀♂各半,随机分为模型组、止咳糖浆组、沙棘糖浆低3.67 g/kg(4.09 mL/kg)、中7.36 g/kg(8.17 mL/kg)、高14.71 g/kg(16.35 mL/kg)剂量组5组。灌胃给药。止咳糖浆组灌胃给予止咳糖浆5.20 mL/kg,空白组灌胃等体积生理盐水,1次/d,给药14 d。按照参考文献[8]进行实验。

1.6 沙棘糖浆对幼龄实验动物消食化滞的作用

1.6.1 沙棘糖浆对幼龄动物消食效果的影响

取120只KM小鼠,♀♂各半。动物适应期喂养结束后,随机分为6组,每组20只,空白组饲喂常规饲料,其余鼠饲喂自制的高热量高蛋白饲料,2 d～7d,加喂0.2 mL/10g的牛奶溶液,2次/d。食积后小鼠精神不佳,活动量减弱,蜷缩扎堆,皮毛色变黄,食量减少,腹部肿胀,粪便呈棕黄色[9]。7 d后其余组别平均摄食量均低于空白组80 %,即造模成功。造模后的实验动物随机分为6组,♀♂各半,分别为空白组、模型组、四磨汤组(3.83mL/kg)、沙棘糖浆低[3.67g/kg(4.09mL/kg)]、中[7.36g/kg(8.17mL/kg)]、高[14.71g/kg(16.35mL/kg)]剂量组。模型组、空白组灌胃等体积生理盐水。1次/d,给药14 d。

代谢笼收集粪便,统计排便粒数,称重粪便。

根据文献[10]测定小鼠胃液 pH 值、胃液游离酸度、总酸、总酸排出量。

ELISA法检测小鼠胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、胃泌素及胃动素水平。

1.6.2 沙棘糖浆对幼龄小鼠胃排空和小肠推进的影响

取100只KM小鼠,♀♂各半,随机分为5组,分别为空白组、四磨汤组(3.83mL/kg)、沙棘糖浆低[3.67g/kg(4.09mL/kg)]、中[7.36g/kg(8.17mL/kg)]、高[14.71g/kg(16.35mL/kg)]剂量组。空白组灌胃给予动物饮用水10mL/kg。每天一次,连续给药14 d。第13 d给药后,禁食不禁水8h,于第14天灌胃给药 40 min后,各组灌胃0.8 mL营养性半固体糊。20 min后颈椎脱臼处死小鼠,结扎贲门、幽门,取胃和小肠, 称取全胃、净胃质量[10]。按以下公式进行计算。

胃残留(g)=全胃质量(g)-净胃质(g)

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 沙棘糖浆对幼龄豚鼠止咳效果的影响

见表1。与空白组相比,沙棘糖浆高剂量组能显著延长豚鼠的咳嗽潜伏期(P<0.01);中、高剂量组均能减少豚鼠5 min内的咳嗽次数(P<0.01、0.05)。

表1 沙棘糖浆对豚鼠止咳的作用

2.2 沙棘糖浆对幼龄大鼠痰液排放量的影响

见表2。与空白组相比较,沙棘糖浆高剂量组能显著增加大鼠痰液排放量(P<0.01),与止咳糖浆组相比,沙棘糖浆高剂量组显著增加大鼠痰液排放量(P<0.05)。

表2 沙棘糖浆对幼龄大鼠痰液排放量的影响

2.3 沙棘糖浆对幼龄小鼠化痰效果的影响

见表3。与空白组相比较,沙棘糖浆中、高剂量组均能显著增加小鼠气管酚红排泌量(P<0.05、0.01),与止咳糖浆组相比,沙棘糖浆高剂量组显著增加小鼠气管酚红排泌量(P<0.05)。

表3 沙棘糖浆对小鼠气管酚红排泌量的影响

2.4 沙棘糖浆对小鼠排便粒数和排便重量的影响

本试验造模1周后小鼠行动缓慢,食欲下降,模型组平均摄食量比空白组下降29.3%,低于正常组20%以上,判定模型建立成功。沙棘糖浆对小鼠排便粒数和粪便重量的影响见表4。与空白组相比较,模型组小鼠排便粒数及排便重量均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,沙棘糖浆低、中、高剂量组能显著增加小鼠的排便粒数(P<0.05、0.05、0.01);中、高剂量组能显著增加小鼠的排便粒重量(P<0.05)。

表4 沙棘糖浆对各组小鼠排便粒数及排便重量的影响

2.5 沙棘糖浆对小鼠胃液 pH 值的影响

见表5。与空白组相比较,模型组小鼠胃液pH值升高(P<0.01)。与模型组相比较,沙棘糖浆高剂量组小鼠胃液pH值显著降低(P<0.01)。

表5 沙棘糖浆对各组小鼠胃液pH值的影响

2.6 沙棘糖浆对小鼠游离酸,总酸,总酸排出量的影响

见表6。与空白组比较,模型组小鼠游离酸、总酸及总酸排出量均升高(P<0.05)。与模型组比较,沙棘糖浆各剂量组小鼠游离酸、总酸及总酸排出量均降低(P<0.01)。

表6 沙棘糖浆对各组小鼠游离酸、总酸及总酸排出量的影响

2.7 沙棘糖浆对小鼠胃功能[胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、胰蛋白酶(trypsin)、α-淀粉酶(α-amylase)、胃蛋白酶(Pepsin)]的影响

见表7。与空白组比较,模型组小鼠GAS浓度升高,MTL浓度、trypsin浓度(P<0.01)、α-amylase浓度(P<0.01)、Pepsin浓度降低。与模型组相比,沙棘糖浆低、中、高剂量组小鼠GAS浓度均降低(P<0.01);MTL浓度均升高,但无统计学差异(P>0.05);高剂量组小鼠trypsin浓度(P<0.01)、α-amylase浓度(P<0.05)、Pepsin浓度(P<0.01)升高。

2.8 沙棘糖浆对幼龄小鼠胃排空和小肠推进的影响

见表8。与空白组比较,沙棘糖浆高剂量组降低小鼠胃残留、增强小肠推进率(P<0.01)。

表8 沙棘糖浆对小鼠胃排空及小肠推进作用

3 讨论

沙棘糖浆是糖浆剂型道地蒙药沙棘药品,主治咳嗽痰多、食积腹痛[11]。研究表明,沙棘总黄酮通过阻断ERK、PI3K/Akt和PKC信号通路,抑制IL-1β等因子诱导性高表达,从而发挥治疗慢性支气管炎的作用[12]。沙棘中还含有多种营养成份,促进胃酸合成,刺激胃液分泌,具有消食健胃的作用[13]。

在止咳化痰实验中,通过幼龄小鼠氨水引咳,幼龄豚鼠枸橼酸引咳,幼龄小鼠气管酚红排泌量,幼龄大鼠毛细管排痰量评价沙棘糖浆止咳、祛痰作用。研究结果表明,沙棘糖浆可以显著改善柠檬酸引起豚鼠的咳嗽,增加大鼠痰液分泌量,有效促进小鼠体内酚红排泌量,说明沙棘糖浆对幼龄动物具有一定的止咳化痰作用。

在消食化滞实验中,通过建立食积症动物模型,观察幼龄小鼠胃残留及小肠推进率,评价沙棘糖浆的对于消食化滞的作用。研究表明,与正常组相比较,给予沙棘糖浆处理后的小鼠胃排空率及小肠推进率明显提高,说明沙棘糖浆可明显改善小鼠胃肠动力功能。胃肠激素GAS、MTL、Trypsin、α-amylase、Pepsin与食积消化不良的发生密切相关。GAS促进胃酸分泌,加强胃肠道运动[14];MTL促进胃蛋白酶分泌,可加速肠胃蠕动及胃排空[15];Trypsin 抑制剂的分泌增加,会导致消化不良,生长停滞[16];α-amylase与胃肠道的消化代谢息息相关[17];Pepsi的活性会随胃酸分泌增多而增强,从而诱发自身消化,造成胃黏膜损伤,促进溃疡形成[18]。本研究结果表明,模型组小鼠GAS表达下调,Trypsin、、α-amylase、Pepsin表达上调,说明模型组小鼠出现明显胃肠动力障碍。经沙棘糖浆处理后,消化不良的幼龄小鼠胃液恢复正常酸度,GAS表达上调,Trypsin、α-amylase、Pepsin表达下调,同时有改善幼龄小鼠便秘,但沙棘糖浆对MTL水平无明显影响,说明沙棘糖浆可能通过促进GAS分泌,抑制Trypsin、α-amylase、Pepsin表达来改善小鼠胃肠功能,从而达到消食化滞的作用。

综上所述,沙棘糖浆具有较好的安全性,本研究为沙棘糖浆的临床儿童用药及推广提供了一定的参考依据。但仍存在一些不足:中药方剂成分复杂,应进一步筛选有效成分进行研究;本研究参照咳嗽的生理病理特点进行动物模型的建立,但未能进行多种模型之间的结果比较,模型评价标准仍需统一;本次研究初步探讨了沙棘糖浆干预前后GAS、MTL、Trypsin、α-amylase、Pepsin表达的变化,在机制方面的研究还有待进一步深入探讨。