张 睿 毋云鹏 武文卿 孙天奇 邱业峰 陈菁青

(军事科学院军事医学研究院实验动物中心,北京 100071)

动物生物反应器是利用转基因技术将外源目的基因导入并整合到活体动物基因组中,使得其组织或器官中可高效表达这种外源蛋白,以实现功能蛋白质工业化生产的技术。按照目的蛋白表达部位的不同,动物生物反应器有蛋清、血液、乳腺、唾液腺、尿液等不同种类[1]。由于乳腺可以高效表达重组蛋白并且可以进行翻译后修饰[2],一般认为乳腺生物反应器是较优的选择,也是目前国际上惟一可以实现商业化的生物反应器[1]。

近年来,随着基因编辑技术的兴起和快速发展,以及人们对高质量生物制品需求的日益增大,大型动物生物反应器平台技术已经日趋成熟,通过转基因技术制备的人源化重组蛋白开始不断涌现。转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)、成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白 9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9)等技术已经成功应用于改善乳成分和生产人源化药用蛋白等方面[3-5],为动物乳汁“人源化”提供了坚实的基础。与蛋清、血液等其他表达系统相比[6],转基因动物乳腺生物反应器具有非常多的优势,如:人源化蛋白表达效率高、生物学活性高、翻译后可修饰、不产生内毒素、生产成本低等。因此,动物乳腺生物反应器是极具发展前景的制药新途径之一。

本文主要对动物乳汁“人源化”在生物制药领域和改善乳成分方面的应用研究、以及其未来的应用前景进行综述和展望。

1 乳腺生物反应器

生物反应器最初是指细胞、细胞提取物或酶进行生物反应的地方,现在一般指的是用于生产重组蛋白质的细胞或微生物的生长室。用于生产治疗性蛋白质的转基因动物生物反应器已存在数十年,在这些系统中生产的几种蛋白质现在正在临床试验中,其中有的已被批准用于市场销售。与其他表达系统相比,乳腺是转基因动物生物反应器的优先选择,产生的乳汁易于大量收集有价值的人源化重组蛋白。

我国的施履吉院士在20世纪80年代初就提出了乳腺生物反应器的构想,并组织6个单位的科技人员开始实施“哺乳动物个体表达系统的研究”。1987年,Gordon 等[5]首次报道了在小鼠乳汁表达人组织纤溶酶原激活素 (human tissue plasminogen activator,htPA)。此后,乳腺动物反应器逐渐成为转基因动物研究领域的热点之一,各种人源化的药用蛋白不断在兔、山羊、绵羊、猪和牛等乳腺和其他器官表达和分泌,目前利用转基因牛、山羊、绵羊乳腺反应器生产的人源化重组蛋白有细胞因子、基因工程疫苗、抗体、酶制剂等,如:人凝血酶Ⅲ、人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人乳铁蛋白、人血清白蛋白等[4,7-9]。20 世纪末,国家“863”计划将乳腺动物反应器归为资助的重大项目,促进了中国动物乳腺生物反应器研究的蓬勃发展。

在生产人源化的药用蛋白方面,研究人员[5]利用TALEN 技术和体细胞核移植技术,在荷斯坦奶牛的β-乳球蛋白位点定点插入了重组人血清白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA)基因,成功获得可以在乳腺特异表达rHSA的转基因牛。有研究[10]利用转基因兔乳腺反应器成功生产出了重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH),得到的转基因兔乳汁中rhGH的表达量可以达到10 μg/mL。

在生产基因工程疫苗、抗体方面,有研究[11]利用TALEN基因打靶技术和体细胞克隆技术将猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)这3种病毒具有免疫原性的结构蛋白基因定点整合到山羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, BLG)基因座,并获得了在乳汁中表达重组蛋白的转基因山羊,该重组蛋白可以诱发机体产生特异性体液免疫反应,为利用乳腺生物反应器研制人源化的亚单位疫苗奠定了基础。有研究[12]利用Cre/loxp重组酶系统将人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,Her2/ErbB2)抗体基因成功定点整合到人溶菌酶转基因山羊细胞内,成功制备了乳腺特异表达Her2抗体蛋白的人溶菌酶转基因山羊。有研究[13]选择兔 β-酪蛋白(casein beta,CSN2)基因座作为整合VP6 基因的靶位点设计了一种适用于基于乳腺生产轮状病毒疫苗的方案,为生产轮状病毒亚单位疫苗提供了一种新策略,并为建立更广泛的基于乳腺生物反应器生产的疫苗奠定了基础。

在细胞因子方面,有研究[9]利用体细胞核移植技术生产了可以在乳汁中表达人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor IX,hFIX)的转基因山羊。有研究[14]构建了三代可以表达重组人凝血因子VIII (rhFVIII)的转基因兔,rhFVIII在几代转基因兔乳汁中均可表达,且乳汁中分泌rhFVIII蛋白的生物活性范围在0.012～0.599 IU/mL,相当于正常人血浆中hFVIII水平的1.2%～59.9% 。

在生产酶制剂方面,美国 GTC Biotherapeutics公司成功在转基因山羊乳汁中获得重组人凝血酶Ⅲ(Atryn),并且通过了 III 期临床试验,于 2006 年获得欧洲药品管理局批准上市,于 2009 年获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准认证,证明了利用转基因动物乳腺生产重组蛋白的实用性,极大的促进了这一领域的科学研究和商业应用[11]。有研究[15]利用克隆技术成功制备出可以在乳汁中特异性表达重组人溶菌酶(recombinant human lysozyme,rhLZ)的转基因猪,在F0代母猪乳汁中具有体外生物活性的rhLZ最高浓度达(2 759.6±265.0)mg/L。有研究[16]通过体细胞核移植技术成功制备可以在乳汁中特异性表达人超氧化物歧化酶1(human superoxide dismutase 1,hSOD1)和人超氧化物歧化酶3(human superoxide dismutase 3,hSOD3)的转基因山羊,在转基因羊乳汁中检测到 rhSOD1和rhSOD3的浓度分别为:(88.81±8.36 )mg/L 和(267.82±12.67)mg/L 。2007年,美国一家专门从事生化防御药物开发的公司(Nexia/PharmAthene)研制出一批表达重组人丁酰胆碱酯酶(recombinant human butyrylcholine esterase, rhBChE)的转基因山羊,其乳汁中产生的rhBChE是人血浆中丁酰胆碱酯酶含量的1 000多倍[17],该rhBChE于2009年完成FDA IND申报和临床I期试验,用于神经毒剂的解毒。

2 乳汁“人源化”的技术方法

基因编辑技术是实现乳汁“人源化”的关键。基因编辑技术是对基因组中目标位点进行改造的一种生物技术,通过精确地插入、删除或替换目标DNA序列,实现基因干扰、敲入、修复等目的。在真核生物细胞特别是哺乳动物细胞中,基因编辑技术由于其高简便性,在基础科学、生物技术和医药领域方面应用具有巨大潜力[18]。

目前在乳汁“人源化”中应用最多的两个主要平台分别是:TALENs和CRISPR/Cas系统。

TALEN 是人工改造的核酸内切酶,来自植物病原体黄单胞菌的 TALE 蛋白具有DNA 结合特异性,高度保守的 33～35 个氨基酸 TALE 重复序列各自结合单个碱基对DNA[19],这些模块化 TALE 重复序列可以链接在一起,构建具有自定义 DNA 结合特异性的长阵列[20]。目前,该技术已经成功运用在了利用乳腺反应器生产人源化重组蛋白[5,21]、基因工程疫苗[11]等方面。

自2013 年CRISPR/Cas9 技术成功应用于哺乳动物的基因组编辑之后,利用 CRISPR/Cas9 系统介导乳汁“人源化”的研究便成为乳腺生物反应器研究领域的一大热门。2017 年,有研究使用 CRISPR/Cas9 系统靶向山羊成纤维细胞中的β-乳球蛋白(BLG )基因座进行BLG基因的敲除,改造羊乳成分,从而获得无BLG表达的山羊,为山羊乳汁“人源化”提供了科学依据[3]。

3 乳汁“人源化”的应用前景

多年来,已有数种高价值的产品在大动物乳汁中生产出来,从国际大公司开发的情况可以看出,高经济价值的医用蛋白和营养蛋白是乳腺生物反应器重要的研发对象,乳腺生物反应器制药无疑是具有前瞻性和革命性的新一代的制药模式。除此之外,在使得乳汁或乳制品更有利于人类健康方面,敲除乳汁中的过敏原基因从而改变乳汁中的原有成分,或者表达一些外源营养蛋白来提高乳汁本身的营养价值,都是极具潜力的发展方向。

在生产医用蛋白和营养蛋白等制药方面,全球众多开展动物乳腺生物反应器的产业化开发的公司中,美国最大的生物技术公司Genzyme Transgenics Corporation(GTC)、英国PPL Therapeutics(PPL)公司和荷兰Pharming是3个出色的以乳腺生物反应器为核心技术的公司。其中,GTC公司率先在羊奶中生产抗凝血药ATryn是世界第一个上市的由乳腺生物反应器生产的孤儿药。2009年Nexia/PharmAthene公司研制的羊奶产rhBChE已完成FDA IND申报和临床I期试验,用于神经毒剂的解毒[17]。2010年荷兰Pharming公司兔奶产遗传性血管水肿治疗孤儿药Ruconest获欧盟批准上市,2014年获FDA批准在美国上市,目前正与上海医工院合作将该药的生产报批引入中国。因此,利用动物乳腺生物反应器生产医用和营养药品具有巨大的市场潜力。

在改良乳品质方面,随着近年来生活水平的不断提高,人们对乳品质的食用要求也越来越高。不论是牛乳,还是在国际营养界被称为“奶中之王”牛乳过敏症患者较理想的替代乳品的羊乳[22],都存在BLG等过敏原,会引起人体过敏反应,且其致敏性无法通过加热、酶水解和糖基化等处理消除,反而会加重过敏反应[23]。因此,消除乳中致敏成分的同时增加功能营养蛋白成分,使其更适合于人类饮用,无疑是提高乳品质的一个重要研究方向。2015年,西北农林科技大学张涌院士团队通过TALEN诱导山羊同源重组生产了不含BLG的高人乳铁蛋白奶[4];2016年,该团队又利用TALEN技术生产了可以在乳腺中表达人血清白蛋白的基因编辑牛[5]。2018年,中国农业大学生物学院戴蕴平团队利用ZFN技术敲除BLG基因产生无BLG牛奶,从而改善人对BLG产生过敏反应的乳糖不耐症,具有极大的应用价值[24]。因此,利用新技术实现对大型动物基因组的精准编辑,按需改造和提高乳品质,也是未来乳腺生物反应器的发展方向。

4 面临的挑战

转基因动物乳腺生物反应器自出现后经历了辉煌的发展阶段,如今更是创造了一个新的现代生物医药产业。虽然其拥有广阔的发展潜力和前景,但在理论和技术方面还存在问题需要不断的解决和改进。

一是转基因动物构建的成功率。由于细胞中同源重组 (homologous recombination, HR) 的效率很低,DNA大片段的敲入受到技术方面的限制,细胞中DNA片段的敲入效率在很大程度上取决于多种因素,例如HR臂的大小、转染方法、标记选择和靶基因位点等。有人建议通过调节细胞周期[25]或非同源末端链接(non-homologous end joining,NHEJ)和HR途径[26-27]来提高敲入效率。此外,添加各种细胞因子也可以提高敲入效率,如:SCR7 吡嗪(NHEJ 抑制剂)处理细胞会降低 NHEJ 并增强 HR[27],RAD51 重组酶 (RAD51) 过表达提高细胞中的敲入效率[26,28-29],RS-1(RAD51-stimulatory compound 1)也可以提高TALEN和CRISPR/Cas9介导的敲入效率[26,30]。2020年,有研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDAC)和RAD51重组酶可以对染色质进行修饰,从而增加TALEN介导的牛β-酪蛋白基因位点的同源重组效率[28]。2022年,研究人员[31]尝试抑制DNA错配修复相关基因(MSH2、MSH3、MSH6、MLH1和PMS2)和过表达 DNA 双链断裂(DSB)修复相关基因(RAD51、CHK1、CHK2)来增加CRISPR/Cas9介导的在牛β-酪蛋白基因位点中人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)的敲入效率。

二是外源基因在乳腺的高效表达。有研究表明,双基因共整合到生物体和细胞中可以产生协同效应,从而提高目的基因的表达水平[32]。研究人员[33]建立了tPA/GH双基因整合的单克隆山羊乳腺上皮细胞系,并分析了tPA在单基因和双基因整合细胞中的表达水平,结果发现双基因整合细胞系中tPA的表达水平显著提高,为今后在转基因动物乳腺生物反应器中高效生产药用蛋白奠定了基础。也有研究表明,可精确切割的高分泌乳蛋白的信号肽也可以提高重组蛋白分泌到乳汁中的浓度,有研究[34]构建了含有山羊BLG信号肽和重组人组织型纤溶酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,rhPA)编码序列的融合载体,结果表明在转基因兔中,山羊BLG信号肽可以有效地介导rhPA分泌到乳汁中,并被内源性兔信号肽酶准确地从rhPA上切割下来,从乳中纯化出rhPA的回收纯度为98%,生物活性没有损失,这一发现证实了rhPA编码区与来自高分泌山羊BLG的可切割异源信号肽融合对提高重组蛋白表达的重要性,可广泛应用于医学上重要的重组蛋白的高产率生产。此外,使用纯合子转基因动物可以有效增加重组人纤溶酶原激活物的表达水平和稳定性[35]。

三是乳腺分泌外源药物蛋白的翻译修饰。研究人员[36]对转基因兔乳腺表达的圆叶山豆根唾液纤溶酶原激活剂α1(desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1, rDSPAα1)进行了鉴定、纯化及药理活性分析,结果表明rDSPAα1具有较强的溶栓活性,证明了可以在转基因兔乳腺中表达具有高溶栓活性的重组DSPAα1。

此外,目前可获得的乳腺上皮细胞存在低细胞活力、低跨代效率和低泌乳功能等问题,不适合用于泌乳机制的后续研究以及将它们用作生物反应器,针对这一情况,研究人员[37]发现小分子化合物可以诱导山羊耳成纤维细胞转分化为泌乳乳腺上皮细胞,为在体外获得大量有功能的乳腺上皮细胞寻找了一条新的途径。

综上所述,尽管乳腺生物反应器还存在一些问题尚未完全解决,但近年来一直在不断改进和完善,与其他技术相比仍然有着不可比拟的优势,是一种理想的药用蛋白的生产工具,有着巨大的经济价值和广阔的应用前景,因此该技术仍然是现代生物医药领域改革的方向。