陈菁青 郑建华 董巧燕 武文卿 孙天奇 邱业峰 张 睿

(军事科学院军事医学研究院实验动物中心,北京 100071)

哺乳动物肠道内栖息着密集而多样的微生物群落,它们与宿主共同进化,互惠共生。随着测序分析手段的进步,特别是高通量测序技术的应用,极大地促进了人类对肠道菌群新物种的发现及功能的了解。肠道微生物群生态系统平衡的紊乱,即肠道菌群失调,与许多疾病的发生和发展密切相关[1],因此,通过调节肠道菌群改善宿主健康具有重大意义。

嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)是一种黏蛋白降解革兰阴性严格厌氧菌,最初从健康人体粪便中分离获得[2],是肠道微生物群的重要成员之一,占菌群总量的1%～5%[3],因具备介导宿主机体能量代谢和营养稳态、免疫应答、大脑活动等关键生理活动的功能,成为一大研究热点。A.muciniphila丰度与肥胖、糖尿病、心血管疾病等代谢综合征以及慢性低度炎性反应、肠炎病密切相关,且具备一定改善疾病和提高机体健康的作用,但因果关系及与宿主相互作用的机制尚不清楚[4-5]。A.muciniphila代谢特性的研究、安全和有效性评价以及与宿主调控机制的揭示为其成为一种有前景的候选益生菌奠定了基础。本文将结合现有研究成果,阐述A.muciniphila与疾病的相互关系,重点探讨其在改善宿主代谢紊乱及肠道炎性反应中的功能及可能作用机制。

1 A. muciniphila与肠道黏膜屏障

黏液是维持肠道健康及功能完整的必要组成部分,不仅是阻止外来有害物质渗透和保护肠道上皮表层的有效屏障,也是物质代谢的良好润滑剂[6]。一方面肠道黏液为肠道微生物的生长、黏附和保护提供底物,另一方面肠道共生菌与病原微生物在管腔竞争生存空间,为黏液的生成和屏障的完整提供营养和必需分子,维持肠道黏膜屏障功能正常。此外,肠道微生物群组已被证明能够影响肠道黏液屏障特性。炎性条件下,某些特定细菌物种丰度的升高能够增加黏液层的通透性,从而降低屏障功能[7]。A.muciniphila广泛定殖于人类和动物的肠道黏膜层,可代谢产生对宿主和微生物群均有益的短链脂肪酸,且具备增强屏障和增加黏液厚度的活性,成为黏液层中连接的关键菌种[8]。研究证明A.muciniphila在婴儿早期就定殖于肠道,并在一年内菌群丰度接近健康成人水平[9]。不同年龄阶段、生理状态及肠道不同部位A.muciniphila的定殖量也不尽相同。健康人结肠中,A.muciniphila定殖数量可高达肠道菌群总量的3%,降解肠黏蛋白产生的乙酸和丙酸等主要代谢产物可进一步被Faecalibacterium.prausnitzii利用产生丁酸盐,抑制肠道免疫和肠道通透性[10]。

A.muciniphila具备有效的调节宿主免疫、提高肠道屏障的功能,且可能在黏膜中抑制病原微生物定殖、提高宿主共生菌竞争力等方面也发挥积极作用[11]。A.muciniphila的丰度与纤瘦程度正相关,可减轻体质量、提高代谢活性,并调节黏液厚度,恢复肠道屏障的功能[12-13]。值得注意的是,在炎症性肠病(主要是溃疡性结肠炎)和代谢紊乱的患者中,观察到低丰度的A.muciniphila,表明它可能具有潜在的抗炎特性[14]。最新实验表明,A.muciniphila增加了内源生物活性物质尤其是胰高血糖素样肽2的产生,参与肠道屏障调节。A.muciniphila在代谢和免疫反应中分子特性的发现及作用机制的揭示有助于挖掘其潜在的治疗应用价值。

2 A. muciniphila与炎性肠炎病

宿主肠道黏蛋白与细菌之间的相互关系受菌群结构变化的影响,黏蛋白降解菌可能参与肠道疾病的发生。研究证明A.muciniphila的丰度与炎症肠病、肥胖症、糖尿病和阑尾炎等疾病的发生负相关,但免疫学作用机制尚不清楚。肠炎患者粪便微生物群中存在A.muciniphila的缺失[15];活检结果也显示,与健康人群相比,炎性肠炎病患者肠黏膜A.muciniphila丰度较低[16]。此外,急性阑尾炎患者体内A.muciniphila数量也减少,且丰度与阑尾炎的严重程度成反比[17]。与健康人相比,溃疡性结肠炎患者和克罗恩患者肠道中A.muciniphila的丰度也显著降低[18-19],而经过标准化-粪便微生物群移植后,A.muciniphila的定殖率和丰度显著增加[20]。然而,也有少量研究报道指出克罗恩患者肠道A.muciniphila的丰度与健康人相比有所增加[16]。总体来看,人体实验结果表明炎症性肠炎病的发病和A.muciniphila的丰度通常呈负相关,提示其在炎症性肠炎病治疗中的潜力。

利用动物进行炎症性肠炎病造模,对于研究其病因、发病机制、临床治疗等方面具有十分重要的意义。炎症性肠病动物模型的构建方法有多种,常用葡聚糖硫酸钠、三硝基苯磺酸等化学物质诱导[21],或利用基因编辑方法敲入或敲除某些基因构建等途径[22]。利用这些方法在成功构建的肠炎小鼠模型中也发现了A.muciniphila丰度的降低,与人体实验结果相一致[23-24]。然而,也有少量文章报道了与上述相反的结论,即在结肠炎小鼠模型中存在A.muciniphila含量升高的现象。结论的不一致可能受各种不同实验因素的影响,例如使用的模型不同,如对Cyp27b1、Hes1和IL-10等不同基因敲除,或用DSS、TNBS等不同诱导剂诱导等方法构建结肠炎模型等。因此,不同模型下A.muciniphila对肠黏膜炎症的发病作用仍需要进一步的探索。

炎性反应是一种先天免疫反应模式,多项研究表明A.muciniphila参与了肠道免疫-炎性反应的调控过程,而揭示因果关系最直接的方法是利用A.muciniphila进行干预。研究显示灌喂A.muciniphila或Amuc_1100膜蛋白可有效减少DSS诱导小鼠结肠中巨噬细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的浸润,同时减少结肠炎小鼠脾和肠系膜淋巴结中的CD16/32+巨噬细胞,缓解结肠炎。此外,A.muciniphila可以通过宿主-微生物互作,改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的肠道屏障功能,降低炎性细胞因子水平,提高肠道微生物群多样性,缓解肠道炎性反应[25]。A.muciniphila还可增加肠道内短链脂肪酸的产生,促进调节性T(Treg)细胞的分化,改变肠道微生物群的组成[26]。肠道中产生的短链脂肪酸可以激活G蛋白偶联受体43 (GPR43),从而增加结肠中Foxp3+Treg的数量,调节免疫反应并缓解结肠炎[27]。体外实验结果证明了人源型A.muciniphilaMucT(ATCC BAA-835T) 菌株与鼠源性A.muciniphila139菌株均具有抗炎作用效果[26,28]。体内实验结果显示,ATCC BAA-835T菌株可以显著改善DSS诱导的慢性结肠炎小鼠的肠道炎性反应,而小鼠来源的A. muciniphila 139未发现有相同的改善效果,提示A.muciniphila的益生效果存在菌株特异性。上述研究表明,A.muciniphilaMucT可能是改善和治疗炎性肠炎病的一种极具前景的益生菌,但作用机制及不同菌株的改善效果还需要进行深入探究。

宿主的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)能够识别细菌相关分子模式,诱导免疫-炎性反应[29]。核苷酸寡聚化结构域样受体(nucleotide oligomerization domain like receptors,NLRs)和Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)是膜上重要的模式识别受体,直接参与细菌的识别,在免疫系统调节中起关键作用。TLR是肠道最有代表性的模式识别受体,其中TLR2/4/5等与细菌识别有关。NLRs和TLRs激活报告实验发现A.muciniphila能特异性激活TLR2受体[30],而TLR2已被广泛证明可调节肠道稳态和代谢[29,31],参与肠道微生物与宿主的相互作用。在对HEK-Blue细胞的研究中有研究[12]也观察到了相同的结果。通过对A.muciniphila外膜进行基因组和蛋白质组学分析,揭示A.muciniphila与TLR2受体之间的作用机制[32]。结果显示,Amuc_1100蛋白是A.muciniphila外膜中最丰富的蛋白之一,且与菌毛的形成有关,推测其可能参与A. muciniphila与宿主之间的相互作用。为了验证这一推测,研究者利用大肠埃希菌表达系统外源表达Amuc_1100蛋白,发现其具备与A.muciniphila一样可激活TLR2表达细胞的能力,进一步证实了Amuc_1100蛋白直接参与A.muciniphila与宿主之间的相互作用[13]。此外,体外实验结果显示Amuc_1100在巴氏灭活处理温度下仍保持稳定,相对耐热。差分光散射分析显示Amuc_1100的融解温度为70° C,恰为巴氏灭菌的使用温度。因此,在巴氏杀灭活处理后,Amuc_1100仍然可能具有活性,并有助于对宿主信号的传导,其功能的稳定可能与巴氏灭活A.muciniphila的益生作用密切相关。通过比较发现,Amuc_1100能有效重复出A.muciniphila的益生作用,且无论活菌、巴氏灭活A.muciniphila以及Amuc_1100均能降低高脂诱导小鼠高胆固醇含量[30]。此外,与活菌相比,巴氏灭活的A.muciniphila及Amuc_1100还能够特异性降低高脂诱导小鼠甘油三酯含量,进一步证实了巴氏灭菌处理能够有效加强A.muciniphila对宿主的保护作用,这一现象的潜在机制可能是热处理暴露了A.muciniphila的活性物质或分子(包括Amuc_1100蛋白等)或抑制性化合物及其组合的失活。

3 A. muciniphila改善代谢性疾病

“代谢紊乱”存在肥胖和胰岛素抵抗等多种临床表现,大大增加了患2型糖尿病或心血管疾病的风险。肥胖模型肠道通透性增加,引起革兰阴性菌的脂多糖穿透屏障进入血液循环,引起代谢性内毒素血症[33]。已有一系列关于肠道微生物群与代谢综合征相互关系的报道。此外,在一项开创性的人类粪便微生物群移植研究中,代谢综合征患者分别接受来自正常个体或代谢紊乱个体的粪便移植。6周后,仅在接受正常供体粪便微生物移植的治疗组中观察到胰岛素敏感性的提高[34]。肠道微生物群改变人类代谢健康的论据已被广泛接受[35],人体研究结果有效的支持了调控肠道菌群改善代谢综合征。然而,目前还没有被证明能够可靠有效的影响和反应人类代谢疾病标志物变化的菌株,因此,针对代谢疾病的微生物治疗方法还需进一步开发。

A.muciniphila丰度与个体的纤瘦程度呈正相关,作为一种有前途的“下一代”益生菌脱颖而出。此外,通过药物或手术途径改善代谢综合征患者的方法均已证实与他们肠道中A.muciniphila相对丰度的增加有关[36]。高脂诱导肥胖小鼠灌喂A.muciniphila活菌可提高胰岛素敏感性,并降低血液循环中的促炎细菌脂多糖的含量[30]。肠源性全身脂多糖浓度的升高能够加剧胰岛素抵抗和代谢综合征的发生和发展。有研究进行了一项为期3个月的随机双盲人体实验研究,使超重/肥胖或胰岛素抵抗受试者每日接受等剂量的A.muciniphila活菌或巴氏温和热灭活的A.muciniphila,探究其对代谢紊乱的改善作用[37]。益生菌菌株通过巴氏温和热灭活可以提高其治疗用途的安全性,并且已被证明巴氏热灭活可以保留相关益生作用的衍生物[38]。此前,小鼠研究结果显示巴氏灭活处理的A.muciniphila增强了降低小鼠脂肪沉积、胰岛素抵抗和血脂异常的能力。临床实验结果[37]显示,每日接受不同处理的A.muciniphila,实验周期为3个月,具有良好的安全性和耐受性,且与对照组相比,接受巴氏热灭活A.muciniphila的治疗个体循环胰岛素水平较低,胰岛素抵抗指数和血液总胆固醇也较低,这表明A.muciniphila的膜成分或其他组分具备改善胰岛素敏感性和血脂含量的功能。此外,巴氏灭活A.muciniphila菌治疗的个体,体循环中二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPPIV)含量更低,而DPPIV酶能够降解胰高血糖素样肽1(glucagonlike peptide 1,GLP-1),一种能够增强胰岛素分泌并具有免疫调节特性的肠道激素。

城乡学生形态指标比较（表1）调查显示，城市男生身高、体重、胸围等3项指标高于农村男生，差异有统计学意义（P＜0.01），城市女生身高、坐高高于农村女生，差异有统计学意义（P＜0.01）。

肥胖和2型糖尿病患者通常伴随血液白细胞数量的升高[39],且受肠道菌群改变的影响,肥胖患者呈现慢性低度炎性反应[40]。巴氏灭活A.muciniphila菌能够有效降低肥胖患者血液白细胞的数量,缓解代谢性内毒素血症,与前期报道的A.muciniphila菌具有抗炎作用的临床前研究结果相一致。此外,巴氏灭活A.muciniphila菌能够显著降低小鼠血清中肝功能标志物谷氨酰转移酶、天冬氨酸氨基转移酶,以及组织损伤标志物-血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶的含量[5,30]。与肥胖小鼠的研究结果相一致,人体实验结果也指出,与活菌相比,巴氏灭活处理的A.muciniphila对机体代谢炎性反应和脂肪肝、心血管疾病等代谢综合征具有更好的改善效果。然而,目前尚不清楚巴氏杀灭活A.muciniphila菌更有效缓解代谢综合征的原因。推测可能是由于巴氏灭活处理后细菌虽无法繁殖,但保持了完整活性成分并防止产生抑制作用的分子,有助于触发有益的宿主反应。细菌代谢物、细胞壁成分和细菌肽为治疗与超重和肥胖相关的代谢并发症提供了一个新治疗策略。事实上,此前同一研究团队已从A.muciniphila的细胞壁中表达纯化了Amuc_1100蛋白,并证明了该蛋白在高脂诱导肥胖小鼠中具有与巴氏灭活A.muciniphila菌同样的治疗效果。肠道微生物中常见革兰阳性菌丰富的细胞壁成分-胞壁酰二肽,也可以缓解肥胖小鼠胰岛素抵抗和提高葡萄糖耐受性[41],进一步证明了细菌来源的分泌因子、细胞成分和代谢物等后生元物质,可以改善代谢疾病。益生菌衍生物或其组分的应用可以克服活菌使用过程中的一些局限性,不仅可以提高治疗的安全性,还可以提高基于微生物的疗法在代谢疾病中的功效。虽然已有小规模人体实验研究证明了巴氏杀菌A.muciniphila应用的安全性和有效性,但仍需要更大规模的人体临床实验来验证巴氏杀菌A.muciniphila在超重或肥胖等代谢异常个体中的治疗效果。

4 结语

A.muciniphila自2004年被发现以来,大多研究都将其的丰度与其益生作用联系起来[42]。如今,A.muciniphila被广泛认为是改善肥胖、糖尿病、肝疾病和心脏疾病等相关代谢紊乱疾病的一种益生菌,而事实也证明,通过A.muciniphila的治疗可以大大缓解这类疾病的发生。通过比较分析,发现已鉴定的下一代有益微生物中,人类肠道菌群中的A.muciniphila是一种非常有前景的候选细菌,且目前的研究结果和功能的发现已为A.muciniphila作为后续益生菌微生态制剂的应用迈出了一大步。首先,通过对A.muciniphila培养条件的优化,已能在人工合成培养基中成功培养出能够快速繁殖和具有活性的A.muciniphila[43]。其次,研究发现巴氏灭活A.muciniphila具有更好的益生效果,解决了活菌应用过程中需考虑的运输、储存条件、保质期和稳定性等问题。第三,Amuc_1100蛋白的鉴别和功能鉴定,揭示了A.muciniphila菌与宿主之间相互作用的关键机制。第四,小规模人体试验证明了A.muciniphila菌的安全有效性。最重要的是,巴氏灭活A.muciniphila菌以及细菌成分,例如相对分子质量较小的30 kU Amuc_1100蛋白的分离和鉴定,为基于A.muciniphila及其产物和衍生物,开发针对糖尿病、炎症性肠病或肠屏障功能受损疾病等的药物研究打开了大门。