周志东,王晓瑜,张 同,李 琪,杨之帆,陈 俊

(1. 武汉科技大学化学与化工学院,湖北 武汉,430081;2. 湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室,湖北 武汉,430062)

苹果酸是一种四碳二羧酸,被广泛用于食品、化工、医药和农业领域[1],常用的生产方法有化学合成法、固定化酶催化法及发酵法等。化学合成法是将苯或丁烷在高温高压下氧化后再利用马来酸的水合作用产生D-苹果酸和L-苹果酸外消旋混合物[2],其中L-苹果酸存在于从细菌到人类的所有生物体中,而D-苹果酸在自然界中很少见且难以被人体吸收利用,故被禁止添加至婴幼儿及老年人食品中。酶催化法是利用固定化的富马酸酶或表达富马酸酶的全细胞,以富马酸为底物催化产生L-苹果酸[3],使用该法虽可获得单一的L-苹果酸,但富马酸酶的纯化成本较高,另外,产物L-苹果酸与反应残留的底物富马酸较难分离,所得L-苹果酸纯度不高。近年来,利用基因工程菌发酵已成为获取L-苹果酸的重要途径[4]。将来自解甘露醇罗尔斯顿菌的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶导入pta突变型的大肠杆菌菌株WGS-10,经12 h好氧发酵后,所得L-苹果酸产量可达9.25 g/L[5]。除此之外,利用苹果酸酶催化丙酮酸也可以生成苹果酸。不过,丙酮酸是多种代谢途径的关键底物,将其转化为苹果酸并非易事。Dong等[6]通过敲除大肠杆菌W3110的ldhA、poxB、pflB、pta及ackA等基因来阻断丙酮酸的旁路消耗,再辅以苹果酸酶的过表达,所得苹果酸产量达到21.7 g/L。本课题组[7]敲除大肠杆菌MG1655的poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB以及pfkA等基因后,将所得工程菌株摇瓶发酵48 h,相应L-苹果酸产量达到9.893 g/L。……